[发明专利]一种GS表达系统细胞株的筛选方法

说明书

本发明公开了一种GS表达系统细胞株的筛选方法，筛选步骤为将含目的基因的表达载体转染宿主细胞后在蛋氨酸亚氨基代砜加压条件下，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～4周,检测发酵液表达量，筛选阳性克隆细胞，放大培养到细胞活率达到85％以上，再用有限稀释法进行单克隆化筛选，筛选时需同时在96孔板中加入密度为1×10⁴～1×10⁵个/孔的宿主细胞并于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～5周后，筛选出阳性单克隆细胞株，即得GS表达系统细胞株。本发明所述筛选方法，克隆化时加入密度为1×10⁴～1×10⁵个/孔的宿主饲养细胞，克隆效率平均可达到22.1％，单克隆化效率大幅提升。

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，特别是一种GS表达系统细胞株的筛选方法。

背景技术

谷氨酰胺合成酶(GS)催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，在哺乳动物体内这是谷氨酰胺形成的唯一途径。在不含谷氨酰胺的培养基中，GS对哺乳动物细胞的存活是必不可少的。一些哺乳动物细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞，不能表达足够的GS，在没有额外添加谷氨酰胺时不能存活。而另外一些细胞系，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，可以表达足够的GS来存活，不需要额外添加谷氨酰胺。在这种情况下，可以用GS抑制剂蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine,MSX)来抑制内源性的GS活性，只有含外源GS基因的转染细胞才可以存活。

谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统将外源基因插入到含有GS基因表达载体的下游，是生物制药行业广泛应用的哺乳动物表达系统之一。宿主细胞可以选择内源性不表达GS基因的重组鼠骨髓瘤细胞NSO、内源性表达GS基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1或Lonza公司开发的CHOK1衍生细胞——CHOK1SV。CHOK1SV细胞表达内源性的GS基因，因此阳性转染子需要在MSX加压和无谷氨酰胺培养基的双重筛选中获得。

获得稳定高产的细胞株的常规筛选步骤为：构建表达载体、转染宿主细胞、加压筛选获得阳性多克隆细胞株、细胞株单克隆化、高表达单克隆细胞株的获得及质量评估。

单克隆化筛选最常用的方法为有限稀释法(limiting dilution cloning，LDC)，主要步骤为在加压条件下以1个/孔或小于1个/孔的细胞密度将多克隆细胞接种到96孔板中培养，待单细胞形成明显的单集落时检测表达量，筛选出阳性高表达的单克隆细胞株。

有限稀释法不需要任何特殊的设备，成本低且易于操作。但该方法对细胞生长状态要求较高，克隆效率极低。M.Celina de la Cruz Edmonds等人有限稀释法筛选细胞时，当接种细胞数为6.25×10²到2.5×10³个/孔时，克隆形成率为0.01％～0.6％，当接种密度为5×10³到1×10⁴个/孔时，克隆形成率也仅为2％～4％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GS表达系统细胞株的高效的筛选方法。

为实现上述目的，本发明提供一种GS表达系统细胞株的筛选方法，筛选步骤如下：

S1：含目的基因的表达载体转染宿主细胞后在蛋氨酸亚氨基代砜加压条件下，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～4周,检测发酵液表达量，筛选阳性克隆细胞；将所得的阳性克隆细胞放大培养到细胞活率达到85％以上；

S2：对S1所得阳性克隆细胞用有限稀释法进行单克隆化筛选，筛选时需在96孔板中加入密度为1×10⁴～1×10⁵个/孔的宿主细胞并于37℃，5％CO₂培养箱中培养，3～5周后观察96孔板中细胞生长情况，标记出单克隆孔，检测发酵液表达量，筛选出阳性单克隆细胞株，即得GS表达系统细胞株。