[发明专利]一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法

权利要求书

1.一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法，包括以下步骤：

1)采用GA₃溶液和水对霸王柴种子依次进行浸泡，所述浸泡重复2次，得到浸泡种子；

2)将步骤1)得到的浸泡种子在体积浓度为75％的乙醇溶液中进行消毒，所述消毒的时间为40s，得到消毒种子；

3)将步骤2)得到的消毒种子在无菌苗培养基中进行无菌苗培养15～20d，得到无菌苗；

所述无菌苗培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括0.3mg/L的GA₃、5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；

4)由所述步骤3)得到的无菌苗获得外植体，将所述外植体在诱导愈伤组织培养基上进行诱导愈伤培养25～30d，得到愈伤组织；所述外植体包括茎段、叶片和/或胚轴；所述诱导愈伤培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括0.1～0.2mg/L的6-BA、0.3～0.5mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；步骤4)所述诱导愈伤培养包括依次进行的暗培养、振荡培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d，暗培养后进行振荡培养，所述振荡培养为25℃、20r/min培养7d；振荡培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25±2℃、光照强度1500～18001x、光照时间14h/d；

5)将所述步骤4)得到的愈伤组织在第一不定芽分化培养基中进行第一分化培养6～8d，再将所述第一分化培养产物在第二不定芽分化培养基中进行第二分化培养25～30d，得到不定芽；所述第一不定芽分化培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；所述第二不定芽分化培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；

6)将所述步骤5)得到的不定芽在生根培养基中进行生根培养，得到霸王柴植株；所述生根培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括0.3mg/L的IBA和10g/L的蔗糖；

所述改良MS培养基为大量元素减少1/3的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述GA₃溶液中GA₃的质量浓度为100mg/L；所述水的温度为40℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)采用GA₃溶液对霸王柴种子进行浸泡的时间为2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)采用水对霸王柴种子进行浸泡的时间为1h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述消毒后，还包括冲洗种子的步骤，所述冲洗的次数为7～8次。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述无菌苗培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d，暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度为1500～18001x、光照时间为12h/d。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述第一分化培养为暗培养，所述第一分化培养的时间为7d。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述第二分化培养为光照培养，所述光照培养的条件为：25±2℃、光照强度1500～18001x、光照时间14h/d。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述生根培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为4d，暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度2000～22001x、光照时间14h/d。