[发明专利]一种检测septin9基因甲基化的核酸组合及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测septin9基因甲基化的核酸组合及试剂盒，涉及分子生物学领域。本发明公开的检测septin9基因甲基化的核酸组合，包括septin9基因甲基化检测引物对，其包括碱基序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.17所示的下游引物，该引物对可以特异性扩增septin9基因目的位点即septin9基因启动子区包含6个CpG位点的第三个CpG岛处，实现对septin9基因甲基化的特异性检测，且具有较高的灵敏度，检出限可低至100个拷贝，克服了ctDNA在血浆中含量低而导致无法检测的困难。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测septin9基因甲基化的核酸组合及试剂盒。

背景技术

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，据统计，2012年全世界约有136万结直肠癌新增病例，发病率居恶性肿瘤第三位；死亡病例约69万，死亡率居恶性肿瘤第四位。

目前结直肠癌的筛查方法主要有3种：粪便潜血试验(Fecal occult bloodtests，FOBT)、肠镜检查和基因检测。1、粪便潜血实验：根据检测的目标不同，FOBT主要分为2类：一是愈创木脂粪便潜血试验(gFOBT)：检测粪便中的含有过氧化物酶活性的物质，如血红素和亚铁红素，通过氧化愈创木脂酸使其变为蓝色。此方法对结直肠癌的特异性较低，主要容易受到摄入食物的干扰，如果食物中含有血红素或者丰富的维生素C就会造成假阳性的结果；二是免疫粪便潜血试验iFOBT：利用血红蛋白，白蛋白或者其他血液成分的特异性抗体检测肠道出血，此方法检测不受食物影响故检测特异性较高，但样本保存时间有严格要求，样本的检出率随着存放时间加长而下降。2、肠镜检查：肠镜检查是一种侵入式的检测手段，需要充分的肠道准备，操作麻烦，此外还有可能引起肠道感染、出血、穿孔等并发症，筛查的普及率很低。3、基因检测方法：septin9甲基化检测方法是近年来新兴的一种用于检测结直肠癌的一种无创筛查方式，有望用于结直肠癌临床筛查。该方法的建立是基于Lofton-Day证明了septin9基因是结直肠癌的基因标志物的理论基础。在Lofton-Day后，不断有学者致力于提高septin9甲基化检测的敏感度和特异度，根据文献报道septin9甲基化检测结直肠癌的敏感度达80％，特异度达90％以上，但市面上用于检测septin9甲基化的试剂盒敏感度只有60％左右，这就成为了septin9甲基化检测走向临床的障碍。

septin9基因甲基化检测主要存在以下技术难题：1、基因检测的对象是血浆中的ctDNA，ctDNA是癌细胞凋亡而释放到血液当中，含量极少。2、甲基化位点不是单个位点，当甲基化达到一定水平时才能调控目标基因的转录和表达，所以甲基化目标位点要覆盖多个关键的CpG岛来保证检测的灵敏性和特异性。3、亚硫酸氢盐转化DNA过程容易出现转化不充分、DNA降解、回收效率低等问题。

septin9基因位于人染色体17q25.3，含有17个外显子，长约219kb，有18种转录产物，编码15种多肽。参与细胞分裂、胞吐作用、细胞极性、细胞迁徙、DNA修复等多种生理活动。

septin9基因活性的改变与多种肿瘤存在密切关系，如白血病、乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、结直肠癌等。在结肠癌的研究表明，结直肠癌组织中甲基化发生于septin9_v2转录本启动子的第三个CpG岛的中央区，具体包含6个核心甲基化位点。

在结直肠癌病人的癌组织的septin9甲基化检出率在80％以上，血浆中的ctDNA主要来源于组织上皮细胞凋亡后释放的基因组，研究发现，血浆和癌组织的septin9甲基化检出率没有显著差异，这就充分证明通过血浆检测septin9甲基化筛查结直肠癌是可行的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测septin9基因甲基化的核酸组合，该核酸组合可基于荧光定量PCR平台，通过TaqMan探针法，实现对septin9基因甲基化的检测，其具有更高的灵敏度和更好的特异性。