[发明专利]一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体是一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备和检测方法。

背景技术

环孢霉素A(Cyclosporin, CsA)是一种内含11个氨基酸的小分子环状多肽化合物。CsA是目前临床常用的同种异体器官或组织移植的排斥反应强效免疫抑制剂，对细胞和体液免疫有较高选择性抑制作用，是一种淋巴细胞激活抑制剂。主要抑制T辅助性淋巴细胞，对T伤性细胞也有较强抑制作用。CsA应用日益广泛，但其具有复杂的药动学和药效学特点，毒副作用多且发生率较高，个体差异大，毒副反应与排斥反应不易区别，监测难度大，其血药浓度过高会引起毒副反应，尤其是对肝、肾的毒性，因此在治疗过程中进行血药浓度监测及药代动力学研究，对提高移植器官的存活率，减少毒性反应和排异反应的发生具有重要的临床意义。

目前检测环孢霉素A的常用方法有：高效液相色谱分析、放射免疫测定（RIA）和荧光偏振法（FPIA）等。其中，高效液相色谱分析费时且不易自动化；RIA法所需时间较长，检测结果不稳定，且存在放射性污染危险。FPIA法需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员。

本发明采用的方法为均相酶免疫检测法，其优点为：操作简便、快速、灵敏度高、准确性好、适合于自动化，应用广泛，并且用全自动生化分析仪对小分子物质和大分子物质都能高通量快速测定。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中环孢霉素A检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、准确检测出待测样本中环孢霉素A含量的环孢霉素A均相酶免疫检测试剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标环孢霉素A、用于检测环孢霉素A抗体-酶标环孢霉素A复合物的指示试剂；上述酶标环孢霉素A由环孢霉素A和葡萄糖脱氢酶偶联而成。

作为本发明进一步的方案，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。

作为本发明进一步的方案，所述的一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物的制备：葡萄糖脱氢酶（GDH）与环孢霉素A偶联，纯化偶联的酶标抗原；

（2）环孢霉素A均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂1的制备：由环孢霉素A抗体和均相酶底物混合而成；

试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。

作为本发明进一步的方案，所述的一种环孢霉素A免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：

1）葡萄糖脱氢酶（GDH）与环孢霉素A（CsA）的偶联

a. 准确称取100-400 mg环孢霉素A，20-100 mg 4-苯甲酰苯甲酸（BBa），装入石英比色皿中，加入5-20 mL叔丁醇，超声溶解；

b. 紫外光照射2-5小时，反应充分，室温静置成冻干粉末；

c. 准确称取2-10 mg GDH溶于0.1-1 mL的PBS溶液中，取上述粉末（CsA-BBa）10-50 mg溶于0.5-2 mL的二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，恒温25℃搅拌下将CsA-BBa逐滴加入到溶有GDH的PBS溶液中；

d. 调节溶液的pH保持在6.0-8.0，再逐滴加入0.5%的碳化二亚胺（EDC）50-200 μL，4℃搅拌过夜；

2）纯化偶联的酶标抗原

通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物，于2-8℃下储存。

作为本发明进一步的方案，所述的一种环孢霉素A免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：

试剂1 的制备：将2-5 g氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、0.5-3 g葡萄糖用0.5-2L磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将环孢霉素A抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；

试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物加到磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000。

作为本发明进一步的方案，所述的环孢霉素A免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将待测样本与环孢霉素A抗体接触；