[发明专利]一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标环孢霉素A、用于检测环孢霉素A抗体-酶标环孢霉素A复合物的指示试剂。

2.根据权利要求1所述的环孢霉素A的免疫检测试剂，其特征在于：所述酶标环孢霉素A由环孢霉素A和葡萄糖脱氢酶偶联而成。

3.根据权利要求1所述的环孢霉素A免疫检测试剂，其特征在于：所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。

4.一种环孢霉素A免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物的制备：葡萄糖脱氢酶（GDH）与环孢霉素A偶联，纯化偶联的酶标抗原；

（2）环孢霉素A均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂1的制备：由环孢霉素A抗体和均相酶底物混合而成；

试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。

5.根据权利要求5所述的一种环孢霉素A免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：

1）葡萄糖脱氢酶（GDH）与环孢霉素A（CsA）的偶联

a. 准确称取100-400 mg环孢霉素A，20-100 mg 4-苯甲酰苯甲酸（BBa），装入石英比色皿中，加入5-20 mL叔丁醇，超声溶解；

b. 紫外光照射2-5小时，反应充分，室温静置成冻干粉末；

c. 准确称取2-10 mg GDH溶于0.1-1 mL的PBS溶液中，取上述粉末（CsA-BBa）10-50 mg溶于0.5-2 mL的二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，恒温25℃搅拌下将CsA-BBa逐滴加入到溶有GDH的PBS溶液中；

d. 调节溶液的pH保持在6.0-8.0，再逐滴加入0.5%的碳化二亚胺（EDC）50-200 μL，4℃搅拌过夜；

2）纯化偶联的酶标抗原

通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物，于2-8℃下储存。

6.根据权利要求5所述的一种环孢霉素A免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：

试剂1的制备：将2-5 g氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、0.5-3 g葡萄糖用0.5-2 L磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将环孢霉素A抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；

试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-环孢霉素A偶联物加到磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000。

7.利用权利要求1至4任意一项所述的环孢霉素A免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将待测样本与环孢霉素A抗体接触；

2）根据待测样本中环孢霉素A与环孢霉素A抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中环孢霉素A的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。