[发明专利]用于分析启动子活性的载体以及基于RNA计数的启动子活性分析方法

权利要求书

1.一种用于分析启动子活性的载体，其特征在于：所述载体的骨架上设置有两个转录单元，分别为转录单元A与转录单元B，所述转录单元A包括待比较的参考启动子Pa、DNAa序列和终止子；所述转录单元B包括待比较的目标启动子Pb、DNAb序列和终止子；其中，所述DNAa序列和DNAb序列来源于同一序列，且DNAa和DNAb之间的个别碱基存在差异。

2.根据权利要求1所述用于分析启动子活性的载体，其特征在于：所述DNAa序列和DNAb序列均为任意的序列或完整的ORF。

3.根据权利要求2所述用于分析启动子活性的载体，其特征在于：所述载体为pARC-gfp载体，序列为SEQ ID No.1所示，其中，

它包括以Gfp基因上的一段序列作为DNAa、DNAb序列，分别如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示，其具体序列如下：

DNAa：

5’-TTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACGCGAGCTGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACGCTCGTCAACCGTATCGAGCTCAAGGGAATCGACTTCAAGGAGGACGGAAACATTCTCGGACACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTTTACATAATGGCGGACAAGCAGAAGAACGGCATTAAGGCCAACTT-3’；

DNAb：

5’-TTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAGACCCGTGCAGAGGTCAAGTTCGAGGGGGACACCCTCGTGAACAGAATCGAGCTCAAGGGTATCGACTTCAAGGAGGACGGTAACATACTCGGTCACAAGCTCGAGTACAACTACAACTCGCACAACGTATACATTATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGGATAAAGGCCAACTT-3’；

它还包括插入参考启动子Pa和目标启动子Pb启动子的，多克隆位点分别为：

MCS1：

5’-GTTGTGAGACCTTTTTAAATTTTGGTCTCTTCTA-3’；

MCS2：

5’-TAGCAGAGACGAAAATTTAAAAACGTCTCACACC-3’。

4.一种基于RNA计数的启动子活性分析方法，其特征在于：首先将DNA分子或者载体转入到宿主细胞内中，然后进行转化，再对受体材料提取总RNA，其包含对应的RNAa和RNAb，再反转录为cDNA，以此cDNA分别为模板，使用一对与DNAa序列和DNAb序列都相匹配的特异性DNA引物进行PCR，得到DNAa-PCR产物DNA与DNAb-PCR产物DNA，计算DNAa-PCR产物DNA和DNAb-PCR产物DNA的数量比，即为参考启动子Pa相对于目标启动子Pb的相对活性比；其中，DNA分子或者载体的骨架上均设置有两个转录单元，分别为转录单元A与转录单元B，所述转录单元A包括待比较的参考启动子Pa、DNA序列DNAa和终止子；所述转录单元B包括待比较的目标启动子Pb、DNA序列DNAb和终止子；其中，所述DNAa和DNAb来源于同一序列，且DNAa和DNAb之间的个别碱基存在差异。

5.根据权利要求4所述基于RNA计数的启动子活性分析方法，其特征在于：所述DNAa-PCR产物DNA和DNAb-PCR产物DNA的数量比通过一代测序或者二代测序的方法获得。

6.根据权利要求5所述基于RNA计数的启动子活性分析方法，其特征在于：所述DNAa-PCR产物DNA和DNAb-PCR产物DNA的数量比的计算方法：首先通过一代测序方法分别获得DNAa-PCR产物DNA和DNAb-PCR产物DNA的测序结果峰值图，然后根据测序结果的峰值图计算差异位点处两种碱基产生信号的强弱比，统计所有的信号强度代表的两种序列的比值，取平均值即得到DNAa-PCR产物DNA和DNAb-PCR产物DNA的数量比。