[发明专利]一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备和应用方法

说明书

本发明为一种α‑丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备和应用方法。该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS‑PEI)，表面再修饰有α‑丁酮酸(KA)，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275μmol/g，修饰的α‑丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0。本发明的微球制备工艺简单、成本较低，应用于蛋白质复性中，可辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取，且不会污染复性体系。

技术领域

本发明属于生物技术领域中的蛋白质复性技术，具体为一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备方法，以及在蛋白质复性中的应用。

背景技术

随着基因重组技术的快速发展，以重组蛋白质为主要成份的基因工程药物已逐步占据医药领域的重要位置。但重组蛋白质在宿主细胞中的高表达常常导致其发生错误折叠和聚集，错误折叠和聚集的蛋白质不具有生物活性，必须在体外对其进行溶解变性使其肽链伸展，然后在合适的溶液环境下使其恢复其天然构型和生物活性。使蛋白质恢复其天然构型和生物活性的过程称为蛋白质的体外再折叠或复性。在蛋白质复性过程中，疏水作用引发的蛋白质分子内的折叠与分子间的聚集为动力学竞争过程，后者的发生会导致复性收率的降低。因此，如何有效地抑制蛋白质聚集，是实现高效复性的关键。

传统的抑制蛋白质复性过程中的蛋白质聚集的方法有：稀释复性、可溶性添加剂辅助复性以及色谱复性等。稀释复性操作简单，但若复性系统混合不利，会使局部蛋白质浓度过高，从而引起蛋白质复性收率下降。可溶性添加剂辅助复性中，多数添加剂能够有效地抑制蛋白质聚集、提高复性收率，但是添加剂的加入往往会在复性体系中引入新的杂质，在后续的分离过程中必须去除。色谱复性可以同时实现目标蛋白质的(部分)分离纯化以及复性，还可以通过调节变性剂或添加剂的浓度来优化色谱复性过程。但是，色谱复性设备昂贵，且操作条件需要严格的优化和控制，才能达到较好的复性效果。

近来有报道提出利用与蛋白质带有同种电荷的微球抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(Mono-sized microspheres modified with poly(ethylenimine)facilitatethe refolding of like-charged lysozyme.Reactive and Functional Polymers,2012,72(11):889-896)。该方法中与蛋白质带有同种电荷的微球能够诱导表面电荷分布不均的蛋白质分子以相反电荷朝向荷电微球表面的形式在微球表面附近发生定向排列。这种定向排列会增大蛋白质分子间的静电排斥作用，从而抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性。与传统的复性方法相比，与蛋白质带有同种电荷的微球辅助蛋白质复性方法操作简单、不会对蛋白质造成污染、微球回收方便且无需昂贵的大型设备。

壳聚糖(Chitosan，CS)是一种无毒性的天然碱性多糖，分子中含有伯胺及羟基基团。聚乙烯亚胺(poly(ethylenimine)，PEI)是一种阳离子聚电解质，分子上含有大量伯胺、仲胺及叔胺基团，完全质子化时电荷密度可高达23.3mEq/g。按照中国发明专利(CN104258830B)所述方法，利用乳化交联法制备交联壳聚糖微球并对其表面进行醛基化，在表面醛基化的交联壳聚糖微球表面接枝聚乙烯亚胺制备得到接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球CS-PEI。该CS-PEI微球是一种阴离子交换微球，其表面的伯胺、仲胺及叔胺等弱碱性基团，可通过质子化而带正电荷，因此可以辅助在复性条件下带正电荷的蛋白质复性。但是，由于CS-PEI微球表面只含有弱碱性基团，只能通过质子化而带正电荷，所以在辅助带正电荷的蛋白质复性后不能对带正电荷的蛋白质进行吸附提取(静电吸附作用只发生在带相反种类电荷的物质之间)；而且，由于CS-PEI微球只含有弱碱性基团，所以也不能辅助在复性条件下带负电荷的蛋白质复性。

发明内容