[发明专利]特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株及构建方法

说明书

本发明涉及一种敲除野生型MTDH后重新高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA‑MB‑231细胞株及其构建方法。利用CRIPR/Cas9系统将乳腺癌细胞系MDA‑MB‑231中内源表达的MTDH进行敲除，之后通过定点突变的方式构建MTDH中棕榈酰化位点和sgRNA识别序列处Protospacer Adjacent Motif(PAM)位点同时突变的MTDH表达载体，借助慢病毒体系和抗性筛选获得特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA‑MB‑231细胞株。经测序和Western Blot检测细胞株中MTDH突变及高表达，最终成功构建内源MTDH敲除而棕榈酰化缺失MTDH特异性高表达的细胞株，可作为研究MTDH棕榈酰化修饰在乳腺癌发生发展中的分子作用机制及所参与代谢调控过程的理想细胞株。

技术领域

本发明是构建一种敲除内源性MTDH，外源高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株的构建方法，涉及生物医学领域。

背景技术

棕榈酰化修饰发现至今已有四十多年的历史，但对其生物学功能以及在肿瘤中的研究却是近几年刚刚开始，它能够调控靶蛋白的胞内运输、亚细胞定位、活性、稳定性、蛋白相互作用等。MTDH作为一种在绝大多数癌症中高表达的癌基因，对肿瘤的研究和治疗具有更为重要的意义，但对其活性和功能的认识却仍处于初期阶段，尤其是对调控定位和功能的棕榈酰化修饰，迄今尚无相关研究，严重限制了MTDH在肿瘤诊断和治疗中的转化应用。研究证实MTDH能够发生棕榈酰化修饰；生物信息学分析显示，MTDH序列中仅存在唯一一个半胱氨酸残基(第75位)，即其棕榈酰化位点，并预测了可能的酰基转移酶。对于MTDH棕榈酰化修饰的研究，对肿瘤中新的肿瘤标志物及肿瘤发生发展的研究具有重要意义，同时也可用于临床早期诊断、预后判断等辅助性治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种借助多种分子细胞生物学手段抑制内源蛋白表达，而使突变型该蛋白外源高表达的方法，并进一步使用该方法构建相应的细胞模型，用于研究目标蛋白的功能以及突变位点的生物学功能，而避免内源野生型蛋白的干扰。

本发明提供的一种特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH蛋白的MDA-MB-231稳定细胞株，是以乳腺癌MDA-MB-231细胞系作为宿主细胞，通过CRISPR/Cas9敲除内源MTDH表达，进一步回补表达突变型MTDH并通过不同的抗性筛选获得的稳定细胞株，构建过程包括MTDHsgRNA的设计、CRISPR/Cas9系统的包装及慢病毒感染、MTDH敲除细胞株的鉴定、棕榈酰化位点及PAM序列双突变MTDH表达载体的构建、慢病毒的包装及感染、突变型MTDH过表达细胞株的鉴定。

特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株的构建方法，是一种内源MTDH敲除而棕榈酰化位点突变MTDH特异性高表达的MDA-MB-231细胞株的构建方法，其特征在于：以乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞作为宿主细胞通过基因敲除(CRISPR/Cas9)和突变基因过表达两步筛选实现敲除野生型MTDH而回补突变型MTDH表达；双突变后MTDH基因序列如下：