[发明专利]NUDT15基因分型用的引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种NUDT15基因分型用的引物、试剂盒和方法。该NUDT15基因分型用的引物、试剂盒及方法利用Taq热启动DNA聚合酶缺少3’‑5’端外切酶活性的特点，当扩增引物的3’端碱基与模板碱基不互补时，会造成扩增产物的急剧减少，据此设计已知点突变的3条引物，其3’端碱基分别与突变型和野生型的模板碱基互补，从而可以将野生型和突变型基因区分开。本发明的NUDT15基因分型用的引物、试剂盒和方法检测流程简单、扩增效率高、特异性强，在分型检测过程中，可配合内参模板、内参引物对和阳性对照、阴性对照等，对实时荧光PCR过程进行全程监控，避免出现假阴性和假阳性的结果，分型结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种NUDT15基因分型用的引物、试剂盒及方法。

背景技术

咪唑硫嘌呤(Azathioprine，AZA)和6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)等巯嘌呤类药物广泛用于治疗癌症、器官移植、自身免疫疾病或炎症性疾病，如炎症性肠病(IBD)。然而巯嘌呤类药物会导致白细胞减少症的发生，这种潜在危害在服用巯嘌呤类药物的欧洲人IBD人群中高达5％。硫嘌呤甲基转移酶(TMPT)突变与巯嘌呤类药物引起的白细胞减少症之间的关系已被证实，并且美国FDA推荐在服用巯嘌呤类药物前进行TMPT检测。然而，服用巯嘌呤类药物引起白细胞减少症的IBD人群，仅有约1/4携带TPMT突变，提示存在其他因素导致该症状的发生，因此TPMT检测的有效性令人质疑。进一步研究表明，欧洲人群的TPMT突变比例(约10％)高于亚洲人群(约3％)，但是，亚洲人群中巯嘌呤类药物引起的白细胞减少症的发生比例却远高于欧洲人群。最新研究表明，NUDT15基因的突变与巯嘌呤类药物引起白细胞减少症的相关性远高于TMPT突变与该症状的相关性，NUDT15基因是不同人群中巯嘌呤类药物引起白细胞减少症的重要遗传决定因素。

NUDT15基因位于人第13号染色体，具体位置为chr13:48611703-48621358(hg19)，基因全长9656bp。该基因共3个外显子，编码区长度为492bp，编码蛋白为nudix水解酶15(nudix hydrolase 15)。NUDT15基因的外显子第415位置(chr13:48619855(hg19))为一个SNP位点，正常情况下，415处的碱基为C(胞嘧啶)，415-417碱基CGT编码的氨基酸为Arg(精氨酸)；发生突变后，415处的碱基变为T(胸腺嘧啶)，415-417碱基TGT编码的氨基酸变为Cys(半胱氨酸)。NUDT15c.415CT突变为胚系突变，该突变在东亚人群最为常见(AF＝10.43％)，其次是拉丁美洲和南亚、欧洲芬兰人，非洲人的突变频率最低。

由于NUDT15基因c.415CT(p.Arg139Cys)突变增强了巯基嘌呤药物诱导的白血球减少症的易感性，因此，对于急性淋巴细胞性白血病、自身免疫性疾病(如克罗恩病、类风湿性关节炎)和器官移植病人，在服用巯基嘌呤药物(Thiopurine)前检测NUDT15基因突变点，确定NUDT15的基因型，有助于指导个体化用药治疗方案。

传统的基因分型的方法有一代测序法、片段长度多态性法(限制性内切酶)、高分辨率熔解曲线法(HRM)和其他基于qPCR的方法。其中，一代测序法测序准确，但是操作步骤多，实验周期长；片段长度多态性分析方法，需要酶切、电泳，容易造成样本污染或酶切不充分；高分辨率熔解曲线法对仪器的温度控制要求较高，适用性较低。尤其是目前市场上并没有NUDT15基因分型的有效检测产品，因此，设计专门的检测NUDT15基因型的检测产品具有十分重大的意义。

发明内容

基于此，有必要提供一种检测效率高、特异性强且不易造成样本污染的NUDT15基因分型用的引物、试剂盒和方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种NUDT15基因分型用的引物，选自如下三组引物中的至少一组：