[发明专利]编码重组人醛缩酶C的核苷酸序列、表达载体、工程菌及生产重组人醛缩酶C方法

说明书

本发明公开了一种编码重组人醛缩酶C的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示，以及重组人醛缩酶C的表达载体和生产重组人醛缩酶C的工程菌。首先，在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌偏好密码子进行核苷酸序列优化同时突变ACA密码子，使其在大肠杆菌中总表达量增加；其次，通过选择低温表达系统，利用在低温条件下，外源蛋白缓慢表达可增进蛋白的正确折叠，提高可溶性与稳定性的优点，使核苷酸序列在大肠杆菌中表达的重组人醛缩酶C占菌体总蛋白的50％以上，可溶性表达量达到总表达量的90％以上，而且表达的人醛缩酶C具有天然的折叠结构，可溶性高，纯化简单，成本低廉。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种编码重组人醛缩酶C的核苷酸序列、表达载体、工程菌及生产重组人醛缩酶C方法。

背景技术

醛缩酶(Aldolase，ALD，D-果糖-1,6-二磷酸:D-甘油醛-3-磷酸裂解酶，EC 4·1·2·1 3)是Meyerhof等人在1936年发现的一种糖酵解同工酶,它催化D-果糖-1,6-二磷酸化学反应,在糖酵解和果糖代谢中起着关键和枢纽作用。研究证明有两类不同的醛缩酶。第一类醛缩酶存在于动植物组织中,称为生成Schiff碱的醛缩酶。第二类醛缩酶存在于细菌酵母、真菌和藻类中,因为这一类醛缩酶带有金属离子,所以称为金属醛缩酶。哺乳动物组织中的醛缩酶主要为第一类，其主要分为三种,即A(肌型),B(肝型)和C(脑型)。它们无论在电泳速率、免疫学特性以及对底物的特异性,还是在成年组织的分布方面,均有明显的差异。A型醛缩酶主要存在于肌肉组织、血细胞和纤维母细胞中；B型主要存在于肝组织、小肠上皮细胞和近端肾小管上皮细胞；而脑皮质星形胶质细胞和心脏组织则富含C型,其次为肝、肾上腺和睾丸组织。

醛缩酶C主要存在于成年动物脑中,在晶状体、视网膜、生殖腺、脾和血细胞中也发现有醛缩酶C活力。已有研究证明醛缩酶C在胚胎时期就已存在，胚胎的心、脾、肺等组织中均有醛缩酶C活力,所以认为醛缩酶C是功能分化完全以前普遍存在的。醛缩酶C被认为与多种疾病的发生发展密切相关。首先，醛缩酶C被认为是肝脏的胚胎性同功酶,肝癌的发生早期即会出现醛缩酶C活力提高；其次，已有研究表明脑脊液或血清中醛缩酶C浓度测定可用于神经病理失调或急性心肌损害的诊断；另外，最新报道表明在糖尿病视网膜病变中，血清醛缩酶C抗体的显著增加与疾病的发生发展密切相关。因此深入研究醛缩酶C的功能对于多种疾病的诊断及治疗具有非常重要的意义。

大肠杆菌系统被广泛应用于重组外源蛋白的制备，其具有生长速度快、发酵条件容易控制、外源蛋白表达量较高等优点，但在大肠杆菌中所表达的外源蛋白有以下缺点：①表达量低，重组外源蛋白占菌体总蛋白的50％以下，可溶性表达量占总表达量的60％以下，②纯化困难，包涵体需要变性复性，纯化步骤多且复杂，③活性低，由于大多为包涵体表达，其蛋白未正确折叠，活性较低。目前，重组人醛缩酶C在大肠杆菌中的表达及制备国内外鲜有报道，因此开发一种能够在大肠杆菌系统高效可溶性表达重组人醛缩酶C的方法对于醛缩酶C的功能研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺少高效表达重组人醛缩酶C的工程菌的缺陷，提供一种编码重组人醛缩酶C的核苷酸序列、表达载体、工程菌及生产重组人醛缩酶C方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

编码重组人醛缩酶C的核苷酸序列hALDC DNA，如SEQ ID NO.2所示。该系列通过在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌偏好密码子进行核苷酸序列优化同时突变ACA密码子，与天然人醛缩酶C的核苷酸序列SEQ ID NO:1，具有90％以上同一性的核苷酸序列。

重组人醛缩酶C的表达载体，包含SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。将hALDC DNA与pCold载体(购自Takara公司)分别用Nde I和BamH I酶切后，使用T4连接酶进行连接得到一种重组表达载体即pCold/hALDC。