[发明专利]一种烟草外植体防褐化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种防褐化方法，尤其是一种烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）为茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana）一年生或多年生的重要经济作物，由于具有易于组织培养和转化效率高等原因，成为当前植物基因工程领域中重要的模式植物。

烟草在进行外源基因功能验证过程中，常常是利用叶盘法通过农杆菌介导导入外源基因后诱导抗性愈伤组织产生直至生出抗性小苗，这个过程一般都是在严格控温抑菌的室内组织瓶内进行，由于温度、湿度、病菌的种种因素的影响，外植体往往会发生褐变反应，进而影响后续工作的顺利进行。

组织培养过程中外植体褐变是影响组织培养成功的重要因素。褐化是植物材料受伤后，体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用下被氧化成褐色的醌类物质的结果，对外植体材料将产生毒害作用，影响其生长和分化，严重时导致死亡。褐化主要与植物材料的基因型和生理状态、取材时期、培养基以及培养条件等有关，在植物组织培养中普遍存在。在试图解决褐化反应的方法中，研究和应用最多的是在培养基中添加防褐剂。

不同种类和数量的防褐剂组合不恰当反而会影响植物本身生长，而且其他用途的物质加入可能会有难以预料的效果，值得探索。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种烟草外植体防褐化方法，在褐化问题得到有效缓解的同时，也能促进烟草外植体的健康生长。

本发明采用解决技术问题方案如下：

一种烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成外植体幼苗；

步骤（3），烟草外植体组织培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗置于MS分化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织。

步骤（4），外植体防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体愈伤组织置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入0.5-1g/L硫代硫酸钠、0.2-0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮、5-10mg/L二硫苏糖醇、30g/L蔗糖、5g/L花生饼粉、3g/L豆饼粉和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（1）中，取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

进一步地，步骤（2）中，所述MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（3）中，所述外植体MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

进一步地，步骤（5）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：

A、配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖、5g花生饼粉、3g豆饼粉、1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；

B、添加0.5-1g/L硫代硫酸钠、0.2-0.5g/L聚乙烯基吡咯烷酮、5-10mg/L二硫苏糖醇和4g琼脂，121℃灭菌15min；

C、灭菌后倒培养基。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：