[发明专利]猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒2型毒株的筛选方法，并且利用该方法筛选的毒株制备疫苗。其制备疫苗的步骤是：1)培养Vero细胞，接入猪流行性腹泻病毒；将培养物反复冻融离心，收集上清冻存备用；2)加入甲醛溶液至甲醛，摇匀后放入37℃温箱中，每隔3h摇匀一次，灭活48h；3)加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为千分之三，以中和甲醛，将中和过的病毒液抽取少许按正常接毒方式接入细胞，进行培养；4)在灭活的病毒上清液中加入灭菌剂，充分摇匀后分装，即为猪流行性腹泻病毒灭活苗。本发明所制备的灭活疫苗与现有猪流感疫苗不同，其可以免疫基因2型的猪流行性腹泻病毒，并且该疫苗可以产生较高的中和抗体，对仔猪有较强的保护作用。

技术领域

本发明涉及生物疫苗领域，特别涉及猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的致病因子。PEDV一直是在东亚(包括我国)和东南亚危害养猪业最严重的几种猪病毒之一，主要以仔猪的腹泻、呕吐、脱水以及引发哺乳仔猪高致死率为主要特征，给养猪业带来了严重危害。基因1型(G1)PEDV在70年代于欧洲首次发现，随后在东亚几个养猪大国相继报道。自2010年秋以来，猪流行性腹泻病在中国大江南北爆发，造成7日龄内的仔猪死亡率高达80-100％，给养猪业带来了极大灾难，随即又在韩国、日本、泰国等亚洲国家出现。2014年，仔猪腹泻重创日本，疫情暴发当月就造成7万多头仔猪死亡。

自2013年5月起，此前从未在美国本土发现的PEDV引发美国多个猪场爆发初生仔猪腹泻及死亡，横扫从中西部到东海岸的43个州，导致10日龄以内仔猪的死亡率高达100％，仅2013年美国死亡仔猪近600万头。目前PED已经蔓延至加拿大和墨西哥。目前，该病已引起世界性的关注。

目前流行于中国与美国的PEDV同属于基因2型(G2)，而G2又可以进一步分为两个亚型，G2a和G2b；基因1型(G1)病毒则包括了PEDV的原型株CV777和早期分离的毒株及其疫苗株，同样也分为两个基因亚型G1a和G1b。G1和G2的主要差异在于S基因上的S1出现了可能的抗原变异。

目前，国内生产的PEDV灭活或弱毒疫苗是基于基因1型的，以CV777为原型的PEDV毒株；而我国目前普遍流行的是PEDV基因2型毒株。由于病毒发生变异，基于传统基因1型PEDV毒株所研制的疫苗的使用效果不佳，亟待2型毒株疫苗推出。

发明内容

本发明的目的在于猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制。

本发明所采取的技术方案是：猪流行性腹泻病毒2型毒株的筛选方法，其步骤是：

1)用PBS将猪场采集的RT-PCR诊断为阳性粪拭子重悬，离心后取重悬液上清接种T25细胞瓶培养的Vero细胞，37℃培养观察；

2)将接种粪拭子悬液后出现细胞病变的Vero细胞反复冻融3次后，离心取上清50μl，接种细胞培养皿培养的Vero细胞，37℃恒温培养，36h后用抗PEDV S1蛋白的单克隆抗体作为一抗、Alexa Flour 596标记的羊抗鼠二抗进行IFA鉴定；

3)鉴定为阳性的病毒液取上清，接种T25细胞培养瓶培养的Vero细胞；37℃恒温培养72h，细胞出现大量病变，反复冻融细胞离心取上清，-80℃保存病毒液。

优选的，判断细胞病变的方法是，细胞颗粒增多，局部细胞界线不清，继之出现含10-25个多核的融合细胞，并可见有空斑样小区，在小区中有融解的多颗粒的多核细胞，空斑区扩展，形成较大的空隙区，最后细胞开始脱落，72h后Vero细胞有合胞体出现。

优选的，IFA鉴定的标准是：细胞病变是由PEDV引起，则病变处的细胞呈现特异性的绿色荧光。

猪流行性腹泻病毒2型疫苗的制备方法，其步骤是：