[发明专利]猪流行性腹泻病毒2型毒株的培养及灭活疫苗的研制

权利要求书

1.猪流行性腹泻病毒2型毒株的筛选方法，其步骤是：

1)用PBS将猪场采集的RT-PCR诊断为阳性粪拭子重悬，离心后取重悬液上清接种Vero细胞，37℃培养观察；

2)将接种粪拭子悬液后出现细胞病变的Vero细胞冻融后，离心取上清，接种Vero细胞，37℃恒温培养，36h后用抗PEDV S1蛋白的单克隆抗体作为一抗、羊抗鼠二抗进行IFA鉴定；

3)鉴定为阳性的病毒液取上清，接种Vero细胞；37℃恒温培养72h，冻融细胞离心取上清，-80℃保存病毒液。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，判断细胞病变的方法是，细胞颗粒增多，局部细胞界线不清，继之出现含10-25个多核的融合细胞，并可见有空斑样小区，在小区中有融解的多颗粒的多核细胞，空斑区扩展，形成较大的空隙区，最后细胞开始脱落，72h后Vero细胞有合胞体出现。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，IFA鉴定的标准是：细胞病变是由PEDV引起，则病变处的细胞呈现特异性的绿色荧光。

4.猪流行性腹泻病毒2型疫苗的制备方法，其步骤是：

1)培养Vero细胞，接入猪流行性腹泻病毒，接种后逐日观察细胞病变，当细胞出现至80％细胞病变时，收取接毒细胞；将培养物冻融离心，收集上清即为病毒液，冻存备用；

2)向上述制备的病毒液中无菌加入40％的甲醛溶液至甲醛终浓度为千分之三，摇匀后放入37℃温箱中，每隔3h摇匀一次，灭活48h；

3)向灭活的病毒液中加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为千分之三，以中和甲醛，将中和过的病毒液接入细胞，进行培养，盲传三代观察应无细胞病变，同时正常病毒液对照；

4)在灭活的病毒上清液中加入灭菌剂，充分摇匀后分装，即为猪流行性腹泻病毒灭活苗。

5.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，Vero细胞长成90％单层时接入猪流行性腹泻病毒。

6.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，猪流行性腹泻病毒接入量为5％。

7.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，灭活的病毒上清液中加入的灭菌剂是氢氧化铝。

8.根据权利要求4所述的疫苗制备方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒由权利要求1～3所述的筛选方法得到，并经过传代培养40代。