[发明专利]一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括RT‑PCR反应液、Taq酶、逆转录酶、罗湖病毒荧光定量反应液以及无RNA酶的去离子水；所述的罗湖病毒荧光定量反应液包括两条检测罗湖病毒的引物和一条检测罗湖病毒的探针，所述的检测罗湖病毒的探针在其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。本发明检测试剂盒(1)具有高度的特异性，其只能扩增出罗湖病毒的核酸，而不与其它病原核酸发生交叉反应的特点；(2)对于罗湖病毒的诊断具有高度的灵敏性；(3)检测结果准确度高，检测速度快。

技术领域

本发明涉及鱼类病毒体外检测技术，尤其涉及罗湖病毒荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，其属于病毒分子生物学领域。

背景技术

从2000年至今，我国罗非鱼养殖量一直居世界第一，近年来，我国罗非鱼养殖产量仍保持增长态势，2015年总产量约178万t，约占全球总产量的30％。罗非鱼产业作为我国出口导向型产业，主要依靠出口贸易来维持产业运转。国内共有133家罗非鱼加工出口企业，总出口量约40万吨，销往97个国家和地区。2002年开始我国罗非鱼的出口量与出口额基本都呈持续增长的态势，2005年罗非鱼出口量为10.74万吨，2009年为25.89万吨，2013年为40.67万吨，创下历史最高水平，总出口额为15.13亿美元。罗非鱼养殖已成为我国出口创汇和渔民增收的重要途径。然而，近年来以色列、厄瓜多尔和埃及等国相继暴发的与病毒有关的养殖和野生罗非鱼大量死亡事件，给这些国家的罗非鱼养殖业造成了重大损失。经研究发现引起这些死鱼事件的病原均为罗湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)，是一种新型鱼RNA病毒。从以色列和厄瓜多尔死鱼事件中病鱼的肝、脑病灶中均发现病毒核酸，同时观察到由病鱼组织分离到的TiLV在培养细胞中繁殖后，接种到健康鱼体内后，可产生相同症状的疾病，提示TiLV为以色列和厄瓜多尔死鱼事件的病因。以色列和埃及两国相邻，但另一个地理上相隔甚远的南美国家厄瓜多尔也发生了由同种病毒引起死鱼事也发生了由TiLV导致的大规模死鱼事件，说明该病毒已经对全球性罗非鱼养殖业造成了威胁。

罗湖病毒病是近几年新出现的一种高致病性和高死亡率的罗非鱼病毒病，病原为罗湖病毒(Tilapia lake virus，TiLV)，感染该病毒的罗非鱼死亡率高达90％以上，TiLV为正粘样病毒科，负链RNA病毒，基因组分为10个节段。截止目前为止，厄瓜多尔、以色列、哥伦比亚、埃及、泰国等多个国家和区域均由此病爆发的报道，中国目前虽然未见罗湖病毒病的相关报道，但多地爆发的罗非鱼病害，其症状与罗湖病毒病及其相似，并且已检测出TiLV，但国内罗湖病毒的流行情况还完全未知。针对TiLV的检测方法，有巢式和半巢式RT-PCR，和原位杂交，这些检测方法操作过程均较为复杂，耗时长，需要特定的仪器设备，且巢式和半巢式RT-PCR的假阳性率比较高，因此，已有的这些检测方法都不适用于罗湖病毒的高效、快速检测，更无法对病毒进行定量分析。