[发明专利]一种鲟鱼TALEN基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种鲟鱼TALEN基因编辑方法，包括将靶基因质粒和针对靶位点的TALEN mRNA混合后，利用显微操作的方式注射到受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极的受精孔中，将靶基因质粒和针对靶位点的TALEN mRNA按1:3浓度比例混合后，采用显微注射方法按100 ng/µL质粒浓度导入小体鲟1细胞期的受精胚中，可以获得存活率74%，外源靶基因突变率高达93%的小体鲟胚胎，本发明第一次建立鲟鱼外源基因精准编辑技术，为开展鲟鱼基因的功能研究和鲟鱼养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

技术领域

本发明涉及水产动物遗传育种和功能基因验证研究的技术领域，更具体涉及一种鲟鱼基因编辑的方法。

背景技术

鲟鱼在生物系统演化方面处于软骨鱼和硬骨鱼之间的过渡时期，具有多倍化的基因组，在研究鱼类基因功能及演化方面具有重要的研究价值。但是，在鲟鱼中开展基因功能研究，现有的报道仅局限于基因克隆和表达模式分析(Abdolahnejad等，2015.Dong等，2015.Fajkowska等，2016.Song等，2016.Yarmohammadi等，2017)。鲟形目鱼类属大型经济鱼类。鲟鱼不仅肉质鲜美，营养全面，富含多种人体必需氨基酸和不饱和脂肪酸，而且是重要的鱼子酱生产材料(Simeanu等，2012)。但是，由于人类过度捕捞及水生态环境的破坏，野生鲟鱼资源急剧下降，很多鲟鱼甚至处于濒危状态(Billard等，2000)。

开展鲟鱼的遗传育种，培育鲟鱼养殖品种，是满足人类对鲟鱼产品日益增长的需求，保护野生鲟鱼资源的关键。但是，鲟鱼的基因功能研究和遗传改良育种一直受制于缺乏有效的技术手段。

基因编辑技术是利用靶向性的序列特异核酸酶对基因组进行定点突变或精准修饰的技术，包括锌指核酸酶ZFN、TALE核酸酶和CRISPR/Cas9系统。基因编辑技术在基因功能研究与经济物种的遗传改良中得到了广泛应用。迄今已在斑马鱼、青鱂等模式鱼类和罗非鱼、虹鳟、鲤鱼、沟鲶、野鲮、半滑舌鳎和黄鳝等经济鱼类中建立了高效的基因编辑技术(Doyon et al,2008；Ansai et al,2013；Qiu et al,2014；Li et al,2014；Yano et al,2014；Zhong et al,2016；Qin et al,2016；Chakrapani et al,2016；Cui et al,2017；Feng et al,2017)。但是，迄今没有在鲟鱼中建立基因编辑技术。

因此，建立鲟鱼基因编辑技术，一方面可以用于鲟鱼功能基因研究；另一方面可以用于探索研制鲟鱼养殖新品系，为养殖鲟鱼提供遗传改良的优良品种，保护鲟鱼野生资源。

发明内容

本发明提供了一种鲟鱼TALEN基因编辑的方法，通过显微注射的方法，将靶基因质粒和针对靶位点的TALEN mRNA利用显微注射方式导入受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极受精孔中，孵化后可获得靶基因突变的鲟鱼。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种鲟鱼TALEN基因编辑的方法，包括在将靶基因质粒和针对靶位点的TALENmRNA，利用显微操作的方式注射到受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极受精孔中。以上所述的方法中，优选的，靶基因质粒浓度为100ng/μL，针对靶位点的TALENmRNA的浓度为100ng～500ng/μL；

以上所述的方法中，优选的，每枚受精卵注射体积为2nL；

以上所述的方法中，优选的，TALEN mRNA的浓度为300ng/μL，TALEN mRNA的左臂和右臂靶点的mRNA按照1:1(质量比)混合。

以上所述的方法中，优选的，所述的鲟鱼包括但不限于小体鲟、施氏鲟(A.schrenckii)、俄罗斯鲟(A.gueldenstaedtii)、西伯利亚鲟(A.baerii)。