[发明专利]一种基于树枝状高分子双重放大标记小分子竞争探针的制备及应用

说明书

本发明涉及一种基于树枝状高分子双重放大标记小分子竞争探针的制备及应用，属于化学发光体外诊断中的化学发光标记领域。该双增强放大小分子标记方法包括如下步骤：步骤一：树枝状高分子‑链霉亲和素‑化学发光信号物质复合体的制备；步骤二：竞争小分子的生物素化标记；步骤三：双重放大化学发光免疫标记检测探针复合体的制备。本发明中双重放大化学发光免疫检测探针，将增强发光强度和增加磁性微球的探测分子结合量两种方式有效结合，利用生物素亲合素间结合作用实现一次放大，同时利用标记了信号物质的树枝状高分子实现另一次放大，双重放大模式极大的提升了化学发光免疫分析信号强度。

技术领域

本发明属于化学发光体外诊断中的化学发光标记领域，具体涉及一种双重放大化学发光免疫标记探针的制备方法及应用、用其制备化学发光检测试剂盒的方法。

背景技术

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。比起传统的酶免分析法，CLIA具有灵敏度更高、检测时间更短、标记方法更简单以及原料成本更低的特点。尽管如此，随着分析检验技术的逐渐普及以及临床上对于检测待测分子灵敏度需求的进一步提高，迫切需要能在CLIA基础上系统性进一步提升灵敏度，降低检测时间的新技术。目前，在免疫分析领域，常用的放大手段是生物素-亲和素放大体系，1981年，Hsu等证明了一个亲合素可以同时结合四个生物素分子，并对两者在免疫学中应用的方法做了详细介绍，通过链霉亲和素亲合素- 生物素的桥接作用，分别结合抗原抗体、标记信号物质等，能极大地增强抗体结合量或信号物质结合量，起到放大的作用。

一般的生物素、亲合素放大体系均采用的是一种放大模式，仅仅利用到生物素和亲合素间的放大效果或是仅针对抗体结合量的增加和放大，不能有效将生物素和亲合素放大模式充分利用起来，往往在面对一些痕量检测时会显得束手无策。

为解决上述问题，利用生物素-链霉亲合素的放大体系加上树枝状高分子标记发光探针来双重放大化学发光信号，研发出一种可以更灵敏、线性范围更宽的检测痕量物质的化学发光试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种双重放大化学发光免疫检测探针的制备方法及用其制备化学发光检测试剂盒的方法，该双重放大化学发光免疫标记探针利用增强化学发光强度和增加探测分子结合量两种放大模式，使得化学发光检测试剂盒竞争信号强度较以往有更大的放大倍数，实现痕量检测。

本发明所提供的双重放大化学发光竞争免疫探针的制备方法，具体可包括如下步骤：

步骤一：取一定摩尔数的树枝状高分子，加入EDC进行活化，在0.05mol/L碳酸盐缓冲液 (pH 9.5)中，加入链霉亲和素，37℃搅拌反应1h，反应结束后按照摩尔比1∶10的比例加入购置的活化信号物质，37℃搅拌反应1h，最后加入0.05mol/LTris-HCl进行封闭反应30min，整个反应结束后，在PBS中透析去除未反应的小分子化学发光信号物质，收集透析后溶液，获得修饰化学发光信号物质和链霉亲和素的树枝状大分子；

步骤二：取购置的活化生物素，按照摩尔比例1∶3的比例同竞争性小分子混合反应，37℃反应1h后备用；

步骤三：将步骤一制得的修饰信号物质和链霉亲和素的树枝状大分子加入到步骤二制得的生物素化竞争性小分子，继续37℃反应30min，即得所述双重放大化学发光竞争免疫探针。

更进一步的，所述的双重放大化学发光免疫检测探针的制备方法，其中步骤一中所述竞争性小分子为抗原如T3、T4、T、E2、E3、P等，所用载体为树枝状高分子，所述信号物质为吖啶酯、三联吡啶钌、鲁米诺等化学发光物质。