[发明专利]阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备方法及应用

说明书

阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备方法及应用，涉及一种胶体金试纸条的制备方法及应用。是要解决现有阪崎肠杆菌检测方法检测周期长，而且检测结果不稳定的问题。方法：一、阪崎肠杆菌抗原的制备；二、抗血清的制备；三、抗血清的纯化；四、多克隆抗体的特异性检测；五、多克隆抗体的二次纯化；六、胶体金的制备与阪崎肠杆菌多克隆抗体的标记；七、胶体金试纸条的组装。阪崎肠杆菌胶体金试纸条在奶粉样品检测中的应用。本发明试纸条的特异性良好，试纸条的检出限为10⁵CFU/mL。检测结果稳定，能够快速获得检测结果。本发明用于制备阪崎肠杆菌胶体金试纸条。

技术领域

本发明涉及一种胶体金试纸条的制备方法及应用。

背景技术

阪崎肠杆菌(C.sakazakii)是一种广泛存在于自然界中，感染后会引发新生儿脑膜炎、败血症、菌血症、坏死性小肠结肠炎以及神经系统后遗症的革兰氏阴性细菌。其繁殖能力及对环境因素的抗逆性非常强，婴儿感染后死亡率高达20％-50％。C.sakazakii的快速检测对控制阪崎肠杆菌危害具有重要意义。

传统检测方法不仅步骤繁琐、检测周期长，而且检测结果不稳定，不能真正起到对致病菌的监测和控制作用。分子生物学检测方法易受试剂和环境影响较大，检测费用相对昂贵；而且在检测过程中仍然需要增菌培养，与免疫学检测方法相比没有速度上的优势。

发明内容

本发明是要解决现有阪崎肠杆菌检测方法检测周期长，而且检测结果不稳定的问题，提供阪崎肠杆菌多克隆抗体的制备方法及应用。

本发明阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：

一、阪崎肠杆菌抗原的制备；

二、抗血清的制备；

三、通过辛酸-硫酸铵方法对制备的抗血清进行纯化；

四、多克隆抗体的特异性检测；

五、多克隆抗体的二次纯化；

六、胶体金的制备与阪崎肠杆菌多克隆抗体的标记

七、胶体金试纸条的组装

进一步的，步骤一中阪崎肠杆菌抗原为阪崎肠杆菌菌体抗原。

阪崎肠杆菌菌体抗原的制备方法为：

将阪崎肠杆菌活化接种于LB固体培养基，37℃恒温培养24h，挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基，于37℃，180r/min摇床培养12h，再按1％的接种量扩大培养接种至3L的LB液体培养基中，37℃，180r/min摇床培养24h，得到菌体培养液；其中所述阪崎肠杆菌为购买得到，菌株编号为ATCC 29544。

5000r/min离心菌体培养液10min，收集菌体，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液洗涤3次后，将沉淀用5mL的0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液重悬，加入15μL福尔马林溶液，室温下放置18h，然后于4℃，5000r/min离心10min，将沉淀用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液洗涤3次后，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲溶液重悬，-20℃保存备用。

进一步的，步骤五中利用杂菌抗原反向吸附法二次纯化多克隆抗体。

进一步的，步骤五中用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金颗粒。其中胶体金颗粒的平均直径为30nm。

上述方法制备的阪崎肠杆菌胶体金试纸条在奶粉样品检测中的应用。

本发明的有益效果：