[发明专利]一种人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸

说明书

技术领域

本发明涉及一种人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸，是一种基于CSpV病毒检测的人兽共患隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸，用于人兽共患隐孢子虫的检测，属于免疫学技术领域。

背景技术

隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的主要以腹泻为主要症状的人畜共患寄生虫病，该病呈全球流行，每年对全球畜牧业造成重大的经济损失，严重威胁人畜的健康。隐孢子虫可感染40多种动物，如牛、羊、犬、猫等均可作为该虫的保虫宿主，隐孢子虫病人和带虫者的粪便和呕吐物中均含有卵囊，都是重要的传染源,食用含隐孢子虫卵囊污染的食物或水是主要传播方式。近年来随着养牛业的迅猛发展，人类与牛的接触也随之增加，因此对牛感染该虫情况的动态监测、诊断并及时治疗，对预防和彻底根除隐孢子虫感染具有重大的意义。

隐孢子虫检测方法繁多且各有利弊，如病原检查法和血清学检查法应用效果较好，简便，易操作，但病原检查法敏感性和特异性都不强。分子生物学方法的特异性和敏感性都较高，但该方法的进行需要有先进的仪器和技术，很难推广，所以鉴于以上情况建立一种行之有效的诊断方法非常必要。

微小隐孢子虫病毒（Cryptosporidium parvum virus , CSpV）是一种dsRNA病毒，到目前为止的所有报道中，发现所有感染人的隐孢子虫中均存在CSpV，且CSpV在微小隐孢子虫中存在稳定，数量较多，每个微小隐孢子虫子孢子中大约有500个病毒颗粒，一个卵囊包含4个子孢子，所以利用CSpV检测隐孢子虫方法的灵敏度提升了2000倍之多，这也为后续CSpV方法的建立提供了依据。

到目前为止，已经在人和260多种动物体内鉴定出30个隐孢子虫种和40多个基因型，其中在人体发现了21个种基因型，绝大多数人体隐孢子虫病是由微小隐孢子虫和人隐孢子虫引起，且均含有微小隐孢子虫病毒。由于CSpV特异的存在于感染人的隐孢子虫类型中，故对CSpV的检测可以作为人感染隐孢子虫的重要指标，且目前基于CSpV病毒建立的隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸方法尚未见报道，该方法的建立为今后隐孢子虫的研究防控和公共卫生安全起到积极的作用。

发明内容

本发明提供一种基于CSpV建立的检测人兽共患隐孢子虫的胶体金免疫层析试纸及制备方法，以检测牛微小隐孢子虫为示例，利用CSpV单克隆抗体和多克隆抗体，建立了检测隐孢子虫的胶体金免疫层析试纸及制备方法。

本发明提供的一种基于病毒检测的隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；其特征在于：

金标垫上的金标抗体为CSpV单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的指示线T线包被CSpV兔多克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体；

本发明所述的一种基于病毒检测的隐孢子虫双抗夹心胶体金免疫层析试纸的制备方法，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对单克隆抗体进行标记，制备金标垫，组装试纸条，CSpV多克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线；具体步骤如下：

（1）胶体金的烧制

利用柠檬酸三钠还原法，向99mL ddH2O中加入1mL 1%氯金酸，沸腾后加入1mL 1%柠檬酸三钠，直至酒红色后，停止加热，制备40nm胶体金颗粒；

（2）金标抗体的制备

取1mL胶体金溶液，加入4µL 0.2mol/L K₂CO₃和6μg CSpV单克隆抗体，对单抗进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上；

（3）试纸条的组装

取21mm的NC膜贴于PVC底板上，裁剪好的金标垫（8mm×3.2mm）压NC膜上2mm，样品垫（22mm×32mm），压在金标垫上2mm，吸水纸（32mm×32mm），压在NC膜上2mm，粘在底板上，按压保证各组状部分紧紧粘好。

（4）检测线（T）与质控线（C）

将多抗浓度稀释到0.5mg/mL，取1µL点于检测线（T）位置，将羊抗鼠抗体浓度稀释到0.25mg/mL，取1µL点于质控线（C）位置。

本发明的积极效果在于：基于CSpV病毒制备双抗夹心胶体金免疫层析试纸，用于人兽共患隐孢子虫的检测，高特异性和敏感性，利用CSpV单克隆抗体和多克隆抗体双抗夹心的方法，其中单克隆抗体保证了本方法的特异性，多克隆抗体又提高了本方法的敏感性，使检测结果更加确实。制备的隐孢子虫检测胶体金试纸条具有快捷、便于操作、不需要特殊仪器等特点，检测结果清晰，可以较快的进行判断，适合于临床现场的快速诊断和牧区等大规模流行病学调查。