[发明专利]一种基于代谢途径改造的生产2-酮基-L-古龙酸的方法

说明书

本发明属于基因工程和微生物发酵领域，公开了一种基于代谢途径改造的利用酮古龙酸菌单菌高效生产2‑酮基‑L‑古龙酸(2‑KGA)的方法。该方法通过启动子的筛选，密码子的优化，构建了一条新颖的糖代谢途径，从而获得了一株2‑KGA高产菌株。该重组菌株可高效地将L‑山梨糖转化为乙酰辅酶A，从而提高生物量和2‑KGA产量。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及一种基于代谢途径改造的利用酮古龙酸菌单菌高效生产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)的方法。

背景技术

维生素C(Vitamin C,Vc)，又称L-抗坏血酸，是人体必需的一种维生素。Vc应用广泛，常作为抗氧化剂添加于食品、药品、化妆品中。2-酮基-L-古龙酸作为合成维生素C的前体物质，其合成途径主要有“莱氏法”和“微生物二步发酵法”。“莱氏法”涉及七步化学反应，其反应过程长，且生产过程中需要大量的危险化学试剂，对环境污染严重。微生物二步发酵法是我国研制的具有自主知识产权的微生物发酵方法。该生产工艺包括两个步骤：第一步是醇糖转化，是在葡糖酸杆菌的作用下将D-山梨醇转化为L-山梨糖。第二步是糖酸转化，是在混菌作用下将L-山梨糖氧化为维生素C的重要中间体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。在糖酸转化过程中，混菌发酵体系主要由酮古龙酸菌和伴生菌组成。酮古龙酸菌含有负责糖酸转化的全部酶系统，负责将L-山梨糖转化为2-KGA，而伴生菌既不能利用L-山梨糖作为碳源也不能利用L-山梨糖作为底物，但对酮古龙酸菌的生长起伴生作用。维生素C混菌发酵涉及两步发酵、三株菌株，其工艺流程长，操作繁琐，发酵过程易污染，且伴生菌作用机制不清楚。酮古龙酸菌SPU_B003能够不依赖伴生菌而独立生长，独立产酸，具有独特的生长特性。

糖酵解(EMP)途径和磷酸戊糖途径(PPP)作为基础代谢途径，广泛存在于几乎所有生物中。在EMP途径中，己糖分解成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下生成乙酰辅酶A，并释放CO₂。在PPP中，己糖磷酸化形成6-磷酸葡萄糖，随后在磷酸葡萄糖酸脱氢酶的作用下转变成5-磷酸核酮糖，并伴随CO₂的释放。这两步脱羧是由己糖生成乙酰辅酶A的过程中造成碳损失的主要反应。

磷酸转酮酶(XFP,EC 4.1.2.22)是双歧杆菌糖代谢过程中的关键酶，是一个双底物特异性的酶，能够接受6-磷酸果糖或5-磷酸木酮糖为底物，催化生成4-磷酸赤藓糖或3-磷酸甘油醛，并释放乙酰磷酸。磷酸转乙酰酶(PTA，EC 2.3.1.8)能够催化乙酰基团从乙酰磷酸转移至辅酶A。因此，XFP和PTA共同作用可直接将己糖转化为化学计量单位的乙酰辅酶A，避免CO₂的释放，降低碳损失，从而提高己糖利用率。因此，在酮古龙酸菌中构建XFP-PTA糖代谢途径，该途径作为EMP，PPP和ED途径的竞争途径，能够降低L-山梨糖在EMP，PPP和ED途径的流量，使碳流有效地从L-山梨糖流向乙酰辅酶A。细胞内高水平的乙酰辅酶A能促进组氨酸蛋白乙酰化，促进菌的生长和分裂，从而提高生物量和2-KGA产量。XFP-PTA糖代谢途径并不局限于2-KGA的生产，新的代谢途径在以己糖为碳源的发酵过程中具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于：针对维生素C发酵过程中工艺流程长，操作繁琐，发酵过程易污染，且伴生菌作用机制不清楚的问题，提供一种利用酮古龙酸菌单菌高效生产2-KGA的方法。

本发明提供的高效合成2-KGA的方法，可通过如下技术方案实现：

首先通过网站预测启动子，然后利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因筛选内源性启动子，最后通过基因工程技术改造酮古龙酸菌，构建高效合成乙酰辅酶A的新颖的糖代谢途径，以减少由L-山梨糖生成乙酰辅酶A过程中CO₂的释放，提高碳的利用率，使L-山梨糖有效地生成2-KGA。

即包括如下步骤：

(1)筛选酮古龙酸菌内源性启动子；

(2)在酮古龙酸菌中构建XFP-PTA糖代谢途径；