[发明专利]一种基于代谢途径改造的生产2-酮基-L-古龙酸的方法

权利要求书

1.如SEQ ID No:1-4所示的核苷酸序列在提高酮古龙酸菌的2-酮基-L-古龙酸产量中的应用。

2.一种基于代谢途径改造的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)根据酮古龙酸菌基因组序列，通过BPROM预测得到内源性启动子p1和p2，序列分别如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；

(2)利用gfp基因作为报告基因，对启动子活性进行鉴定；

(3)根据酮古龙酸菌密码子偏爱性优化外源磷酸转酮酶基因xfp和磷酸转乙酰酶基因pta，优化后的片段分别为xfp2502和pta2145，序列分别如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示；

(4)通过PCR扩增xfp2502、pta2145、p1和p2四个片段，再通过overlap PCR将p1和xfp2502、p2和pta2145片段连接起来得到p1xfp2502和p2pta2145两个片段；

(5)将p1xfp2502和p2pta2145插入到pBBR1MCS-2质粒上，得到重组质粒pBBR-p1xfp2502-p2pta2145，

将重组质粒pBBR-p1xfp2502-p2pta2145电转至E.coli WM3064中；

(6)通过接合转移将重组质粒pBBR-p1xfp2502-p2pta2145从E.coliWM3064转移至酮古龙酸菌中，所述的酮古龙酸菌是能够独立生长和独立产酸的Ketogulonicigenium robustum SPU_B003；

(7)将步骤(6)中得到的重组酮古龙酸菌首先进行种子培养，然后进行发酵培养，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。

3.如权利要求2所述的一种基于代谢途径改造的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增酮古龙酸菌内源性启动子p1和p2所用引物分别是：

p1F:AAGCTTTGGGGTAAAATAATACCGTTTTTGTAACGCAC和

p1R:TGTCTTTTCCAGTATACGCGGACAC、

p2F:ACTAGTTTCGGTGTCAGAAGCCCTACTG和

p2R:GTGCGTCGTCACCTTTCGATC。

4.如权利要求2所述的一种基于代谢途径改造的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增xfp2502和pta2145所用引物分别为：

xfp2502F:ATGTGCCGTTCGACCGGTG和

xfp2502R:AAGCTTAAAAAAAACCCCGCCCTGTCAGGGGCGGGGTTTTTTTTTTACTCGTTGTCGCCGGCCG、

pta2145F:

GATCGAAAGGTGACGACGCACGTCTCGCGTATCATCATGCTGATC和

pta2145R:

GCTCTAGAAAAAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTTTACTGCTGTTGGGCCGATTG。

5.如权利要求2所述的一种基于代谢途径改造的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，步骤(7)所述发酵培养的条件是：温度28-32℃，摇床转速为180-220rpm，发酵时间60-84h。