[发明专利]一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用

说明书

本发明提供了一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用，该方法为选取新鲜动物蹄筋肌腱，去除肌肉和油脂，分离获得白色的肌腱组织，剪碎获得小块肌腱组织，采用低温酸法溶解组织，获得胶原蛋白酸溶液；低温离心去除未降解的组织；胶原蛋白上清液经过冷冻干燥获得胶原蛋白粉末；该胶原蛋白粉末经过精确称量，重新溶解在酸溶液中，获得一定浓度的蛋白溶液。该胶原蛋白经过中和处理，可以形成胶原蛋白胨，胶原蛋白膜，以及与其他生物材料复合形成不同形式的功能材料。本发明的优点在于取材方便，价格低廉，制备过程简单、稳定，具有良好的生物相容性。可以应用于化妆品添加物、医用生物材料、组织工程、细胞培养等领域。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法及应用。

背景技术

胶原蛋白主要存在于人和动物的多种组织器官中，在组织器官形状维持和正常生理功能中发挥重要作用。因其具有良好的生物相容性和可降解性，已经广泛应用于细胞培养、生物学、化妆品等领域。此外，胶原与其他材料结合制备的复合功能材料可以为损伤组织提供支架，也可以结合干细胞或者生长因子等，起到促进组织功能修复的作用。

现有商品化的胶原蛋白来源主要包括，鼠尾胶原，动物皮，牛筋膜提取的胶原等。鼠尾胶原来源有限，动物皮胶原成分较复杂。牛筋膜组织较复杂，非基质胶原成分难以去除等缺陷。

为了获得胶原成分相对单一，免疫源性较低的高纯度胶原蛋白，动物肌腱组织成为可选材料之一。肌腱组织致密，其中主要的细胞成分-成纤维细胞是胶原蛋白合成的主要来源，胶原成分主要为1型胶原。因此，动物肌腱组织来源充足，成分较单一，病原体感染较少，动物的基因和人比较接近，相容性较好等优势。因此，本发明以动物蹄为例，提取动物肌腱胶原蛋白成分，以期提供新的胶原蛋白材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白提取方法及应用。

本发明一种动物蹄筋肌腱胶原蛋白的提取方法，具体包括如下步骤：

(1)分离动物蹄筋肌腱：利用剪刀解剖分离动物蹄内白色肌腱，去除肌肉、脂肪和油脂和表面筋膜，无菌去离子水冲洗，获得白色肌腱。

其中，肌肉、脂肪、油脂和表明筋膜等去除干净与否，决定了肌腱胶原蛋白的纯度，需要尽量去除干净。

(2)将肌腱组织分解成微小组织：肌腱组织经过酒精消毒，无菌去离子水冲洗后，用锋利的剪刀将肌腱剪碎成微组织，加入充足的去离子水，用无菌的滤纸吸走表明油滴，清洗直至完全去除油脂。

步骤(2)中，对所述肌腱组织消毒是，所述酒精浓度和作用时间为75％-80％酒精消毒3-5分钟，再用无菌水清洗5次以上。肌腱组织剪碎成(1～3)mm³的微组织。该步骤是为了减少污染，促进肌腱组织溶解。

(3)低温酸处理肌腱组织：将肌腱微组织除水，加入一定浓度酸溶液，充分混匀，置于低温冰箱溶解数天，期间震荡促进溶解。

步骤(3)中，低温酸处理肌腱组织所需酸溶液为弱酸溶液(如冰醋酸)，体积百分含量为0.2％-5％冰醋酸水溶液，低温范围在4-8°，肌腱微组织和所述体积百分含量为0.2％-5％冰醋酸水溶液的配比为2g:100ml，溶解时间为4-10天，每天震荡5次以上。该步骤是为了促进肌腱组织充分溶解。

(4)提取胶原溶液：将溶液置于无菌离心管中，低温高速离心，收集上层液体，去除底部未溶解的组织。

步骤(4)中，高速离心提取胶原溶液，采用离心速度(10000-12000)转/分钟，离心时间10-20分钟。该步骤是为了去除未溶解的胶原组织。

(5)胶原粉末获得：将离心后的上清胶原溶液转移到无菌的器皿中，冷冻干燥获得胶原粉末；根据溶液量，调整冷冻干燥时间。该步骤是为了获得精确蛋白浓度的胶原蛋白溶液。