[发明专利]一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及土壤微生物的科学研究领域，更具体涉及一种研究土壤甲烷氧化菌的方法，同时还涉及一种在土壤中原位标记13C-CH₄气体的装置，该装置同样适用于在土壤中标记其他同位素气体（如15N-N₂O）。

背景技术

大气温室气体浓度增加是导致全球变暖的主要原因，甲烷（CH4）是重要的温室气体之一，其百年尺度增温潜势是二氧化碳的25倍（IPCC,2007）。近年来， CH4在大气中的浓度逐年上升，自1750年以来，甲烷的浓度已增幅150%（IPCC, 2014），对全球气候和环境产生了极为严重的威胁。稻田是重要的CH4排放源之一，其每年的CH4排放量占全球人类活动造成的CH4排放总量10% （Nazaries et al., 2013）。稻田甲烷排放是CH4产生过程和CH4消耗过程的净效应，是产甲烷菌和甲烷氧化菌共同作用的结果（Le Mer and Roger, 2001）。土壤中CH4生成是产甲烷菌在严格厌氧条件下作用于有机肥料、动植物残体、土壤腐殖质以及水稻根系分泌物等土壤有机质的结果。而土壤中CH4的消耗是由甲烷氧化菌进行的，约19% ~ 83%的甲烷气体被土水界面和根土界面的甲烷氧化菌所氧化（Zhang et al., 2012）。所以利用13C-甲烷气体来标记水稻土中的甲烷氧化菌，进而研究土壤中活性的甲烷氧化菌群落组成结构，具有十分重要的意义。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法。以往对于活性甲烷氧化菌的原位研究是通过在土壤中加入饱和甲烷水溶液，或者甲烷气体经过植物的通气组织到达土壤，进而对土壤甲烷氧化菌进行同位素标记。与以往方法不同的是，本方法可直接在土壤中原位标记甲烷气体，硅胶管内甲烷气体能缓慢的释放到管外，到达土壤中，从而提高对甲烷氧化菌的同位素标记效率。并且可在根际土和非根际土中同时进行同位素气体标记。

本发明的另一个目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，该装置制作简单，操作方便。装置中的硅胶管透气不透水，管内的同位素气体能缓慢的作用于土壤微生物。连接硅胶管的不锈钢针头，长度为10厘米，远高于培养盆的水平面，不易进水，能有效防止污染，且同位素标记时更易操作。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的方法，包括如下步骤：

1）将硅胶管装置分别埋入根际和非根际土壤中，土层高于硅胶管顶部，称取3kg土壤样品，装入培养盆中，培养盆尺寸为16×20cm（直径×高）。盆中设置两个尼龙网根袋，直径7－9厘米的尼龙网根袋中放入三根硅胶管装置，直径5－7厘米的尼龙网根袋中放入一根硅胶管装置，尼龙网根袋中及培养盆中分别装入土壤。

2）在培养盆中加入去离子水，保持淹水状态，约2－4厘米水层，沿培养盆的侧壁加入去离子水，使土壤上方持续保持2－4厘米的水层。

3）淹水一周后，移栽水稻幼苗，淹水一周后，移栽水稻幼苗。水稻品种为中佳早17，幼苗苗龄18－22天。移栽时最好选择阴天，或者在温室大棚的顶部铺上遮阳网，以防止幼苗水分蒸发过快。将幼苗置于水盆中，轻轻洗掉幼苗根部的土壤，选取5株长势相同的幼苗，移栽到7－9厘米的尼龙网根袋中。

4）水稻苗龄45天时（即分蘖期）开始标记13C-甲烷气体；标记时在硅胶管装置上的三通阀上连接2个5ml注射器，其中1个是空的，另1个已吸取了3ml 13C-CH4，将三通阀的开口旋至空的注射器，从硅胶管内吸取3ml气体，然后将三通阀的开口旋至有13C-CH4的注射器，让甲烷气体自然吸入至硅胶管，避免用力推注射器，以防增加硅胶管内压力。然后每8个小时按此步骤注射一次，共标记6天。通过6天的13C-CH4同位素标记，土壤中的甲烷氧化菌以13C-CH4作为能源，通过消耗13C-CH4从而变成13C-甲烷氧化菌，通过后续的稳定同位素技术即分离出这部分13C-甲烷氧化菌。

一种同位素原位标记土壤甲烷氧化菌的装置，它由硅胶管、硅胶塞、不锈钢长针头、三通阀、植物、尼龙网袋、培养盆组成。其连接关系是：硅胶塞与硅胶管相连，硅胶管与不锈钢长针头相连组成硅胶管装置。培养盆与两个尼龙网袋相连，其中一个尼龙网袋中与三根硅胶管装置和植物相连，另一个尼龙网袋与一根硅胶管装置相连。