[发明专利]一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种重组乳酸乳球菌的制备方法及应用。其特征在于，在乳酸乳球菌细胞中胞内表达或分泌表达罗非鱼源无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein，Sip)，重组表达Sip蛋白所用载体分别为pNZ8124和pNZ8148，载体中插入的Sip基因片段去除了信号肽区段并添加了组氨酸序列标签，重组蛋白由乳酸链球菌素(Nisin)诱导表达，最佳诱导条件为100ng/mL Nisin诱导4h，最佳口服免疫浓度为2.24×10¹⁰CFU/mL，口服剂量为100μL。本发明所公布的重组乳酸乳球菌应用于罗非鱼无乳链球菌的乳酸菌活载体疫苗具有血清型覆盖范围广，可直接口服，安全性好，操作简便，易于大规模群体免疫，免疫效果较好等优点。

技术领域：

本发明涉及一种罗非鱼源无乳链球菌的乳酸菌活载体口服疫苗的制备方法及应用，具体是利用乳酸乳球菌活细胞作为载体制备用于预防罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，GBS)感染的口服疫苗及其应用方法。

背景技术：

罗非鱼(Tilapia)是一种原产于非洲的热带性鱼类，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(亦称丽鲷科，丽鲷属)。由于它具有生长快、食性杂、繁殖力强、无肌间刺和营养丰富等特点，受到广大养殖户和消费者的喜爱。罗非鱼在我国南方的广东、海南、广西和福建等省份广泛养殖，养殖规模和养殖密度不断加大，已成为我国目前出口量最大的淡水鱼类养殖品种。2009年以来，链球菌病在我国罗非鱼的主养区大面积暴发流行，并且发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增。2011年我国90％的罗非鱼养殖场均出现链球菌病，死亡率为15％～90％。链球菌病已成为罗非鱼养殖业中最严重的病害，给渔民带来了巨大的损失，同时成为制约我国罗非鱼产业健康可持续发展的瓶颈。

罗非鱼链球菌病主要集中于高温季节爆发流行，流行水温26℃以上，其主要症状为体色发黑、眼球突出、浑浊发白、水体中打转、体表点状或斑块出血等。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)是罗非鱼链球菌病的主要病原，2008年之前我国罗非鱼链球菌病病原以海豚链球菌为主，之后逐渐转变为以无乳链球菌为主要致病菌。无乳链球菌又称B族链球菌(group B streptococcus,GBS)，为革兰氏阳性球菌，是一种广泛分布于自然界的条件致病菌，其根据荚膜多糖抗原性的差异可分为10种分子血清型(Ⅰa、Ⅰb和Ⅱ～Ⅳ)，根据其溶血性可分为α、β和γ溶血。我国流行的罗非鱼无乳链球菌的分子血清型主要为Ⅰa型，也有Ⅰb和Ⅲ型的报道，多位点序列分型结果均主要为ST-7型，噬菌体分型可以分为A、B两类，2010年之后的菌株主要为B型。无乳链球菌除了可以感染罗非鱼，还可以感染虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Psetta maxima)、真鲷(Pagrosomus major)和眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)等多种咸水和淡水鱼类，目前已有12个国家报道了该病的暴发和流行，是全球流行的鱼类病害类型。