[发明专利]一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母

权利要求书

1.一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母,其特征在于，所述的重组Thanatin抗菌肽包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母,其特征在于，所述的毕赤酵母包括毕赤酵母X33、毕赤酵母GS115和毕赤酵母SMD1168中的一种。

3.根据权利要求2所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母,其特征在于，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。

4.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的表达重组Thanatin抗菌肽的载体骨架为pPICzαA。

5.根据权利要求4所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的Thanatin抗菌肽的表达载体为pPICzαA-THA。

6.根据权利要求5所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的表达载体pPICzαA-THA的构建包括以下步骤：

S001、在Thanatin抗菌肽的基因5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点CTCGAGAAAAGA,在Thanatin抗菌肽的基因3’端添加XbaI酶切位点TCTAGA，合成后得到克隆载体pUC-THA；

S002、XhoI和XbaI限制性内切酶双酶切处理步骤S001中得到的pUC-THA克隆载体，得到Thanatin基因片段；

S003、将步骤SOO2中得到的Thanatin基因片段连接至同样被XhoI和XbaI限制性内切酶双酶切处理的pPICzαA载体，构建得到表达载体pPICzαA-THA。

7.根据权利要求5所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的表达载体pPICzαA-THA菌株的验证引物为：

5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，

3AOX-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

8.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的重组Thanatin工程菌的筛选抗生素为0.25-4mg/mL的博来霉素。

9.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述重组Thanatin抗菌肽的诱导表达方法包括以下步骤：

S004、制备种子液：挑选如权利要求1-8所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母细胞，接种于25mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到一级种子液；取20mL一级种子液接种于200mL BMGY培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；

S005、发酵培养：将步骤S004中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2L BSM培养基，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20%±5%，PH为5.0±0.5；

S006、饲喂碳源：步骤S005的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油；

S007、甲醇诱导：步骤S006的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧突然上升，饥饿半小时，流加甲醇诱导Thanatin表达，共诱导120h。

10.根据权利要求1-9任一项所述的表重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，其保藏编号为CDMCC No∶60261。