[发明专利]一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途

说明书

本发明公开一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途，其中，所述特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞细胞包括NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。其制备方法是将含有NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因的慢病毒和含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因的慢病毒同时感染自然杀伤细胞。本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞通过所含的NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因共同作用，提高了该自然杀伤细胞的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，增加了该自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免了肿瘤免疫的逃逸，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞具有较强的非特异性直接杀伤靶细胞的能力，并且这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。NK细胞通过多种细胞表面受体(例如NKG2D，CD16)以及天然细胞毒性受体(NKp44，NKp46，NKp30)识别被感染的和恶性癌变的细胞。这些受体激活含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构的调控蛋白DAP10、DAP12，ITAM能启动细胞毒性颗粒蛋白的释放，并调控IFN-γ和TNF-α等细胞因子和趋化因子的分泌。脾酪氨酸激酶(Syk)是调控蛋白DAP12关键的下游蛋白酪氨酸激酶，当胞外受体与其配体相互作用时，ITAM被酪氨酸激酶磷酸化，招募Syk，进一步磷酸化下游蛋白传递活化信号，从而激活NK细胞发挥作用。

近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞技术在治疗血液系统肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性。但是，最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及系统性神经毒性等高风险因素。另外，由于肿瘤微环境的免疫抑制及免疫逃逸作用，CAR-T细胞在实体瘤治疗方面尚未获得明确疗效。NK细胞由于其特点：发挥杀伤作用不需要预先致敏，也不受主要组织相容性复合物的限制，可以使用异体来源的NK细胞而不会在受试者(患者)体内引起排异反应；不会产生细胞因子风暴(比如，不会发生白细胞介素-6的大量释放)。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。

癌-睾丸抗原(CT)被认为最具有前景的肿瘤相关抗原之一，其特点是在多种组织来源的肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胚胎组织。由于生殖细胞不表达HLA分子，以及血睾屏障的存在，因此针对CT抗原的肿瘤免疫治疗一般不会对正常组织细胞产生免疫毒性。NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，并在多种肿瘤组织(恶性黑素瘤、肝细胞癌、卵巢癌等)中表达而在肿瘤治疗领域备受关注。

尽管如今出现了一些含有与NY-ESO-1特异结合的特异受体的转基因NK细胞，但大部分用于NK细胞中表达的CAR都是仅有T细胞CD3ζ结构域的一代CAR载体，与NK自身兼容性不高，同时增大转染后NK细胞的负荷，使得转染效率偏低；另外，由于肿瘤逃逸机制的存在，使得该转基因NK细胞激活下游信号不足，降低了当前转基因NK细胞的杀伤效果。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，旨在解决现有的转基因自然杀伤细胞由于肿瘤逃逸机制的存在，而导致该转基因自然杀伤细胞激活下游信号不足的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，包括NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。

优选地，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因设于NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段中。