[发明专利]一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用

说明书

本发明公开了一种合成DL‑丙氨酸的三基因共表达载体的构建及应用。根据同尾酶原理，将假坚强芽胞杆菌中编码丙氨酸脱氢酶(ald)、丙氨酸消旋酶(alr)和葡萄糖脱氢酶(gdh)基因串联插入到改造过的质粒pET‑22bNS上，构建三基因共表达载体pET‑22bNS‑G/A/A。所构建的三基因共表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，以重组菌株全细胞催化反应3h后L‑丙氨酸和D‑丙氨酸的产量最高，分别为7.0和6.5mg/mL，二者的最高合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d。本发明所构建的三基因共表达载体具有高效合成DL‑丙氨酸的能力，具有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的构建方法及应用，属于酶工程和化合物生物合成技术领域。

背景技术

DL-丙氨酸是一种非天然氨基酸，也是重要的手性中间体，广泛应用于食品、化妆品和制药等方面，国内外市场对其需求量日渐增大。现有技术中，DL-丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法、化学合成法和生物酶法，其中，化学合成法反应机制复杂、工艺过程长、生产成本高；发酵法生产周期长、设备投资大、分离复杂、成本高；生物酶法是利用微生物所产生的酶催化底物转化生成DL-丙氨酸，该方法具有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但由于所需酶蛋白的稳定性差、活性低、生产成本高。正是由于这些缺点的存在，上述三种方法均不符合工业化生产的要求，难以满足市场的需求。因此，开发高效合成DL-丙氨酸的生产方法具有非常重要的意义。

早在1997年日本京都大学Kenji Soda教授等提出利用4酶偶联合成D-氨基酸(Galkin et al.,1997)，即利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶协同作用参与催化合成D-氨基酸，该方法转化效率较高，但高活性、高稳定性的酶蛋白的获得是此方法能否成功开发的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体。

本发明的目的还在于提供一种含合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法。

本发明基于上述方法，以葡萄糖脱氢酶替代甲酸脱氢酶，用于催化反应中还原型辅酶NADH的再生；利用同尾酶原理将葡萄糖脱氢酶(gdh)、丙氨酸脱氢酶(ald)和丙氨酸消旋酶(alr)三基因串联构建多基因共表达载体，使每个基因均带有独立的启动子(T7启动子)、核糖体结合位点(RBS)、终止子(T7终止子)等表达调控元件，各基因的表达相对独立；以含有多基因共表达载体的重组菌体全细胞进行催化，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新途径。

本发明的目的是这样实现的：一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其核苷酸序列由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成。其中：

(1)SEQ ID No.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

(2)SEQ ID No.2所示序列为编码基因gdh的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；

(3)SEQ ID No.4所示序列为编码基因ald的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；

(4)SEQ ID No.6所示为编码基因alr的核苷酸序列。

本发明还提供三个编码基因gdh、ald和alr的氨基酸序列，如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5和SEQ ID No.7所示。

本发明还提供含有上述三基因的共表达载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述三基因共表达载体的工程菌。