[发明专利]一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用

权利要求书

1.一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成，其中：

(1)SEQ ID No.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

(2)SEQ ID No.2所示序列为葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；

(3)SEQ ID No.4所示序列为丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；

(4)SEQ ID No.6所示序列为丙氨酸消旋酶基因的核苷酸序列。

2.一种含权利要求1所述三基因共表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据质粒pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域核苷酸序列信息，设计突变引物，通过PCR突变技术引入限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

所述引物为：

Nhe-F01:5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01:5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01:5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

以质粒pET-22b(+)为PCR模板，使用上述设计的引物，利用PCR突变技术将T7启动子和终止子待突变区域分别突变获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点，改造获得质粒pET-22bNS；

(2)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌OF4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，通过PCR扩增获得目的DNA；

所述各基因扩增引物为：

Gdh-F01:5′-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-3′

Gdh-R01:5′-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-3′

Ald-F01:5′-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-3′

Ald-R01:5′-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-3′

Alr-F01:5′-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-3′

Alr-R01:5′-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-3′

以来自假坚强芽胞杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4的基因组DNA为模板，使用上述设计的引物，利用PCR技术扩增获得目的DNA片段，通过限制内切酶将目的DNA与经相同酶切处理的质粒pET-22bNS连接，构建表达载体pET-22bNS-Gdh0、pET-22bNS-Ald0和pET-22bNS-Alr；

(3)在不改变氨基酸序列的前提下，根据待突变区域的核苷酸序列设计定点突变引物，通过定点突变技术构建同义突变以消除相关限制内切酶的识别位点；

所述突变引物为：

Gdh188D-F01:5′-CTCTGCCCCAGACCTAGCACAGGAC-3′

Gdh188D-R01:5′-GTCCTGTGCTAGGTCTGGGGCAGAG-3′

Ald107L-F01:5′-GCAAAAGCACTCGTAGACAGCG-3′

Ald107L-R01:5′-CGCTGTCTACGAGTGCTTTTGC-3′

以质粒pET-22bNS-Gdh0和pET-22bNS-Ald0为模板，使用上述设计的引物，利用定点突变技术分别消除葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶基因中的BglII或SpeI识别位点，改造获得质粒pET-22bNS-Gdh和pET-22bNS-Ald；

(4)利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和NheI或SpeI逐一双酶切处理表达载体pET-22bNS-Gdh，pET-22bNS-Ald和pET-22bNS-Alr，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-G/A/A。