[发明专利]一种抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗体‑海兔毒素偶联物的制备方法，包括以下步骤：(1)提供C端具有LPXTG序列的抗MART‑1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA‑A2复合物的单克隆抗体、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在Sortase A酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述单克隆抗体与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗体‑海兔毒素偶联物。本发明通过定点偶联使每分子的抗体带上4分子的MMAE毒素，均一性良好，且在体内实验中展示了良好的肿瘤杀伤能力；与现有ADCs靶点相比，CLA12‑vcMMAE ADCs拓展了目前ADCs靶点的选择面，论证了胞内蛋白通过MHC I分子的递呈也可以作为ADCs药物靶点的这一观点。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

MART-1蛋白是一种只在黑色素细胞和大部分黑色素瘤细胞中才会表达的黑色素瘤相关抗原，并且在黑色素瘤细胞中呈高表达，据不完全统计，100％的黑色素瘤样本都有MART-1蛋白的表达(Barrow C等，Clin Cancer Res.2006 Feb 1；12(3 Pt 1):764-771)。因此，选择以MART-1蛋白为靶点设计的药物将在黑色素瘤中有较为广泛的应用。

进20年来，单克隆抗体领域的快速发展使其在临床的肿瘤治疗领域有着举足轻重的作用，例如西妥昔单抗，曲妥珠单抗，利妥昔单抗等一系列单克隆抗体都在各自的肿瘤适应症上均表现出了良好的临床治疗效果。他们通常是通过抑制肿瘤细胞的关键信号传导通路和Fc段诱导产生ADCC，CDC效应来达到抑制肿瘤细胞生长和杀伤肿瘤细胞的目的(WeinerLM等，Nat Rev Immunol.2010 May；10(5):317-327.)。

抗体偶联药物(Antibody-drug conjugates，ADCs)是一种结合了单克隆药物和化学修饰/偶联技术的新型生物药物，它将单克隆抗体和毒性小分子通过linker技术连接在一起，不仅具有单克隆药物优良的靶向性又具有小分子毒物的高细胞毒性，使其能快速、精准的到达肿瘤部位，并在被肿瘤细胞内吞之后在细胞内释放毒性小分子，达到更快更强的杀伤肿瘤细胞的目的。然而我们注意到，无论是临床使用的单克隆抗体还是抗体偶联药物，他们所针对的靶点仍然是细胞膜表面的膜蛋白胞外区，而对于胞内的高表达或者突变的肿瘤相关蛋白仍然无可奈何。

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)，简称MHC，具体分为两类。其中MHC I类分子复合物由MHC I类分子，β2-微球蛋白和长度为8-11个氨基酸的递呈肽构成，其中MHC I类分子又可以主要分为HLA-A、B、C三大类。细胞通过自身的MHC I类分子将由蛋白酶体水解自身蛋白产生的多肽递呈至细胞表面(York IA等，Annu RevImmunol.1996；14:369-396.)。基于这一理论，黑色素瘤相关抗原MART-1蛋白的26-35位氨基酸：EAAGIGILTV形成的多肽正可以被HLA-A2分子递呈至细胞表面。正是这一理论使得胞内蛋白也可以成为抗体乃至抗体偶联药物的靶点。

单克隆抗体具有稳定的结构和良好的靶向性，但是普通的偶联方式如氨基，巯基的偶联方式，有可能会使得抗体的稳定性或者靶向性下降。

Sortase A是从金黄色葡萄球菌中分离的催化转肽反应的酶，其184位的半胱氨酸亲核攻击LPXTG(X表示天然氨基酸中任意一种)标签中苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的肽键，形成共价硫代中间体，同时释放出甘氨酸及其羧基C末端肽段。该中间体通过捕获溶剂中的甘氨酸底物从而在苏氨酸和捕获的甘氨酸底物之间形成新的肽键，释放出sortase A酶进行下一步催化。由于该反应特异性高、操作简单、反应条件温和，sortase A已被广泛用于蛋白质工程和蛋白质定点修饰。

发明内容