[发明专利]具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及木聚糖酶XynB的构建，尤其涉及具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法。

背景技术

青贮作为一种保存越冬饲料作物青绿多汁的传统方式，是以新鲜的青绿饲料为原料，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密闭条件下，通过厌氧发酵，将植物表面的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，导致饲料pH降低，来抑制腐败微生物菌群的生长繁殖，从而达到保持作物的营养特性的目的。木聚糖作为一种多聚五碳糖，是植物细胞壁中的主要结构非淀粉多糖，是植物半纤维素的重要组成部分，占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。但在青贮发酵过程中，乳酸菌不能分解植物的半纤维素，而微生物木聚糖酶却能水解木聚糖生成长度各异的木寡糖，对半纤维素降解起着关键作用，其能大幅度提高木质纤维素物质的利用效率，因此在饲料工业、食品工业和造纸工业中具有巨大的应用前景。如在制作青贮饲料过程中添加木聚糖酶，木聚糖酶就能把植物中的半纤维素成分降解转化为小分子的单糖、寡糖，不仅便于牲畜的吸收利用，还能为青贮过程中，乳酸菌的发酵提供营养。谷物作物(水稻、玉米、小麦等)中存在抑制木聚糖酶活性的木聚糖酶抑制蛋白，能对木聚糖酶的应用产生负面影响。为了进一步提高该类饲料的青贮品质，在青贮过程中添加抗抑制活性木聚糖酶是非常必要的，且具有重要的现实意义和重大的经济价值。

研究表明小麦等谷物作物中存在能抑制木聚糖酶活性的蛋白质成分，称为木聚糖酶抑制蛋白。1997年，内切木聚糖酶抑制蛋白首次在小麦中发现(Debyser et al.,1997)。2005年，木聚糖酶抑制蛋白首次在水稻中发现(Goesaert et al.,2005)。木聚糖酶抑制蛋白还在黑麦、大麦、玉米和高粱等谷物中都有发现。木聚糖酶抑制蛋白按结构分为三大类：XIP型木聚糖酶抑制蛋白、TAXI型木聚糖酶抑制蛋白和TLXI型木聚糖酶抑制蛋白(Debyser et a1.,1997；Fierens et a1.,2007；MeLauchlan et a1.,1999)。谷物作物整个发育过程中都存在木聚糖酶抑制蛋白，且木聚糖酶抑制蛋白存在谷物的各组织中，如根、芽、叶及发育和萌芽的谷物等(侯春晓,2014；王明道等,2010；Xin et a1.,2014)。这就对木聚糖酶应用领域中酶功效的发挥提出了挑战：抑制蛋白的存在是否影响外加木聚糖酶的作用？据估算(Gebruers et a1.,2005)，小麦面粉中抑制蛋白的含量远大于应用过程中外加木聚糖酶在其中的比例。而小麦基础饲粮中抑制蛋白也影响了对抑制蛋白敏感的木聚糖酶添加剂的作用(Perez-Vendrell et a1.,2003)。因此，我们应当足够重视木聚糖酶抑制蛋白对木聚糖酶应用领域产生的负面作用。令人值得欣喜的是，研究表明木聚糖酶抑制蛋白能抑制外源木聚糖酶的活性(尤其是细菌等来源的)，但却无法抑制植物内源木聚糖酶的活性(Dornez et a1.,2010)。但是，直接从植物中提取分离木聚糖酶，需要耗费大量植物，而且工艺复杂，所得木聚糖酶活性也不理想。然而目前，对于植物内源性木聚糖酶的克隆和表达研究还相对较少。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法。

本发明上述目的通过以下技术方案来实现：具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法，提取小麦全基因组，并采用以下特异引物扩增小麦的Xyn B基因第三外显子内的活性位点序列，电泳切胶回收DNA片段经限制性内切酶EcoR V和EcoR I酶切后与载体pET30a+构建重组表达载体，经转化菌转化后获得重组质粒pET30a-Xyn B，重组质粒pET30a-Xyn B转化至工程菌，经培养后获取单克隆菌落，转至培养基中培养并诱导蛋白表达，获得重组木聚糖酶XynB；其中，所述的特异引物为：

正向引物：5’-tcgatatcatgcagctggacaacgcctt-3’，划线部分为EcoR V限制性内切酶位点，

反向引物：5’-tcgaattctgcgtccgtcttccactccc-3’，划线部分为EcoR I限制性内切酶位点。

本发明所述的限制性内切酶采用EcoR I和EcoR V。所述工程菌选用原核表达感受态菌株Ecoli.BL21(DE3)。

本发明具有以下优点：