[发明专利]使用CRISPR-CAS系统对间充质干细胞进行GINS2基因敲除的方法

说明书

本发明提供了一种采用CRISPR‑cas9系统针对间充质干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的间充质干细胞细胞系的建立。其中使用了新的增效蛋白CREnhancer1.0，能够显著提高细胞内CRISPR/Cas9基因编辑效率。本发明提供的骨髓间充质干细胞GINS2敲除质粒具有较好的遗传稳定性。

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对间充质干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的间充质干细胞细胞系的建立。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植，而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位。例如，被注入心脏的间充质干细胞能够形成健康的新组织等。

间充质干细胞(MSCs)是一类多能干细胞，源于发育早期的中胚层和外胚层。主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

间充质干细胞的临床研究已经在许多国家开展，美国批准了60余项临床试验，随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，我国也批准了多项临床试验，走入了间充质干细胞核心技术研发的舞台。我国已经大力加强干细胞研究工作的开展，包括国家昂赛细胞基因工程有限公司、细胞产品国家工程研究中心在内的多家权威研究机构以及各地方脐带血库已将研究技术引向临床。对于间充质干细胞用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病，肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。迄今的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

GINS2是DNA复制复合体GINS家族成员之一，位于人染色体16q24上，其mRNA长度为1196bp，编码相对分子质量为21000的蛋白质。GINS是一种复制解旋酶，在移动到复制叉前打开DNA双链。研究表明，GINS家族成员在癌症的发生中起一定作用，如GINS家族成员在侵袭性黑色素瘤中过表达，也有文献表明，DNA复制相关蛋白在不同细胞中有不同的作用，如在决定中心体复制数量和疾病发生的不同阶段方面，GINS均发挥了一定功能，特别是与染色体的分离密切相关。