[发明专利]组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途、试剂盒及其筛选方法

权利要求书

1.组合型血清代谢标志物在制备用于诊断肝病发展进程试剂盒的用途；

所述组合型血清代谢标志物主要由甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸组成。

2.一种用于诊断肝病发展进程的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

标准品：甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠标准品、甘氨鹅脱氧胆酸标准品、甘氨脱氧胆酸标准品、甘氨胆酸标准品和牛磺鹅脱氧胆酸标准品；

含内标提取液：浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标甘氨胆酸-d5的低碳醇溶液，浓度为0.01～1μmol/L的含有同位素内标牛磺鹅脱氧胆酸-d5的低碳醇溶液。

3.根据权利要求2所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒，其特征在于，所述含内标提取液中的低碳醇溶液为甲醇溶液。

4.一种根据权利要求2或3所述的用于诊断肝病发展进程试剂盒筛选组合型血清代谢标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将人体血清与含内标提取液混合，得到混合液，随后对所述混合液进行预处理得到待测样本；

(b)将所述待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(a)预处理的步骤为：将混合液沉淀蛋白后，提取上清并干燥，随后用甲醇溶液复溶后离心，取上清得到待测样本。

6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括如下步骤：

步骤(Ⅰ)：称取甘氨鹅脱氧胆酸钠硫酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅脱氧胆酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；

步骤(Ⅱ)：将权利要求2中含内标提取液分别加入步骤(Ⅰ)得到的标准液中，定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤(Ⅲ)：将步骤(Ⅱ)得到的待测标准液和权利要求4中步骤(a)得到的待测样本通过液质联用检测，对人体血清中的组合型血清代谢标志物进行筛选。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(c)液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量：5～50μL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为乙腈溶液，流动相的流速为0.1～2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0min，A：90～30％、B：10～70％；

4min，A：90～50％、B：10～50％；

5min，A：1～20％、B：99～80％；

8min，A：1～20％、B：99～80％；

8.1min，A：90～60％、B：10～40％；

10min，A：90～60％、B：10～40％。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C18或C8键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.7～4)μm。

9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为C8键合相色谱柱，规格为50mm×2.1mm，1.7μm。

10.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(c)中液质联用检测的质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。