[发明专利]一种东京四照花抗褐化和组培增殖方法

说明书

本发明公开了一种稳定、高效的东京四照花抗褐化和组培增殖方法，包括以下步骤：1）取材：春季4～5月晴好天气，取当年生无病害、生长健壮的营养枝；2）灭菌：灭菌方法为酒精30s+0.1%升汞7min的组合；3）无菌抗褐化体系建立：消毒后的茎段平摊于已消毒滤纸上晾干，接种于含200mg·L^‑1 PVP抗褐化剂的培养基中，待芽长至3～4cm，进行增殖培养；4）增殖培养：将诱导生成的芽接种于增殖培养基（WPM+1.0 mg·L‑16‑BA+0.05 mg·L‑1NAA）中，每隔20～25天继代一次。本发明优化了东京四照花组培增殖的各个阶段，有效降低褐化率到17.87%，提高增殖系数高达3.09。

技术领域

本发明涉及一种东京四照花抗褐化和组培增殖方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

东京四照花(Dendrobenthamia tonkinensis)属山茱萸科(Cornaceae)四照花属(Dendrobenthamia)植物，为常绿小乔木或灌木。其树形优美，枝条平展，层次分明(Hattaet al，1999)，可春观亮叶，夏赏玉花，秋看红叶红果，被广泛应用于园林绿化、公园造景、盆栽艺术；其叶敷伤口可消肿，根、种子煎水服可补血，具一定药用价值；其果含高脂肪与高钙，可鲜食、制醋和酿酒，是一种具营养价值的野生水果(韩维栋，1993；Vareed，2005)；其木材坚硬，纹理通直细腻，易加工，是良好的用材树种(辛蕾，2009)。综上所述，该树种集观赏、食用、药用和材用价值于一身，是很有开发利用前景的多用途珍贵树种。

东京四照花目前的繁殖方式主要是实生繁殖、嫁接、扦插和组培繁殖。实生繁殖无法保证树种的优良特性，且东京四照花种子具深休眠性，播种两年才能萌发，延长了育苗周期，增大了育苗成本。无性繁殖能保持树种的优良性状，是种群扩繁的常用方法。但扦插繁殖需要一定条件的温度、湿度和营养物质、特殊的活性物质的参与，操作复杂，生根率低；嫁接繁殖繁殖系数低，接穗需求量大，繁殖周期长，生产效率低，以上三种方法均无法满足市场需求，实现东京四照花规模化生产。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统东京四照花繁殖方法存在的育苗周期长、繁殖系数低、生产效率低等问题，提供了一种稳定、高效的东京四照花抗褐化和组培增殖方法，通过优化东京四照花取材、消毒、无菌抗褐化体系建立、不定芽诱导、增殖培养等各个阶段的操作，有效提高东京四照花不定芽的抗褐化能力，促使东京四照花在较短时间内产生大量具亲本优良特性的不定芽，为后期东京四照花快繁体系建立奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明提供一种东京四照花抗褐化和组培增殖方法，其特征是，包括:

(1)外植体的选取：取样时间为春季4月至5月，选取当年生健康、无病害的带芽茎段；

(2)外植体的灭菌：先用70％～75％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗2～3次后，再用0.08％～0.1％的升汞浸泡7～8min，用无菌水冲洗4～5次后备用；

(3)无菌抗褐化体系建立：将修剪好的茎段插入灭菌的培养基中，用封口膜密封后放入培养室培养，所述培养基为WPM基本培养基，激素组合为6-BA和NAA，浓度分别为1.0～2.0mg·L^-1和0.05～0.2mg·L^-1，添加蔗糖25～30g·L^-1、琼脂粉6.5～7g·L^-1、抗褐化剂PVP100～200mg·L^-1，并调节pH至5.70～5.78；