[发明专利]一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法

说明书

本发明涉及一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法，步骤如下：(1)制备待观察肠道；(2)取待观察肠道，制备固定后样品；(3)将固定后样品截段后，剥离肌层，然后剥离神经丛上的纵形肌，置于磷酸缓冲液中保存，制得待染样品；(4)将待染样品经磷酸缓冲液冲洗后，浸入封闭液室温封闭，然后浸入一抗溶液中，室温孵育，制得一抗样品；(5)将一抗样品浸入山羊抗兔IgG的溶液中，摇床孵育，避光显色，然后经脱水、封片，即得。本发明首次采用肠壁全层铺片‑NOS免疫组化技术制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品，制备过程中通过在制备样品前注射肌松药、剥离纵形肌，较为容易的实现了环形肌与纵形肌的分离。

技术领域

本发明涉及一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

肠神经系统(enteric nervous system,ENS)由肠壁肌间神经丛，粘膜下神经丛等组成，参与调节胃肠道的运动和分泌等功能。胃肠道蠕动主要源于并依靠平滑肌收缩，而平滑肌的兴奋主要由乙酰胆碱等兴奋性递质介导，抑制主要由一氧化氮(NO)等抑制性递质介导。1990年Bult首次提出了胃肠道氮能神经元兴奋时释放NO。一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase，NOS)在体内能催化L-精氨酸生成NO，是NO生成的标志酶。以往多用NADPH-黄递酶组化法研究哺乳动物的NOS阳性神经元，但其特异性较差,并受实验条件的影响。NOS抗体为一氧化氮合酶的特异性抗体，能较好显示NOS阳性神经元的定位，已应用于哺乳动物神经系统NOS神经元的研究。

消化道全层铺片技术是研究胃肠道神经系统的结构和功能基础方法，能够立体直观地显示肠道神经元在黏膜下层和肌间层的分布模式，利用消化道全层铺片技术研究肠道神经系统的法已被广泛接受和应用。但以往的研究主要集中在哺乳动物，仅有少部分文献研究鸡肠神经系统的超微结构。家鸽作为鸟类的典型代表，其肠道NOS神经元的形态及特征，不同肠段分布特点，还未见研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法。

本发明技术方案如下：

一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法，步骤如下：

(1)按0.04～0.06mg/kg向家鸽注射肌松药，5～30min后处死家鸽，取家鸽肠道，清理肠道内容物，制得待观察肠道；

(2)取步骤(1)制得的待观察肠道，结扎小肠的一端，用含有多聚甲醛质量百分比浓度为3.6～4.4％的磷酸缓冲液灌注后，结扎小肠的另一端，在4℃条件下，置于含有多聚甲醛质量百分比浓度为3.6～4.4％的磷酸缓冲液中固定6～8h，转至含200～350g/L蔗糖的磷酸缓冲溶液中，4℃条件下脱水过夜，制得固定后样品；

(3)将步骤(2)制得的固定后样品截段后，剥离肌层，将肌层浆膜面向下平铺于载玻片上，然后剥离神经丛上的纵形肌，保留环形肌层，置于磷酸缓冲液中保存，制得待染样品；

(4)将步骤(3)制得的待染样品经磷酸缓冲液冲洗后，室温置于质量浓度为2.5～3.5％的H₂O₂中25～35min，然后经磷酸缓冲液冲洗后，浸入封闭液室温封闭0.8～1.2h，然后浸入含有质量百分比浓度为0.2～0.5％的一抗溶液中，4℃过夜，然后室温孵育0.8～1.2h，PBST冲洗，制得一抗样品；

所述一抗为兔抗NOS抗体；购买于博士德生物公司；

所述封闭液为每百毫升PBST溶液含有5毫升山羊血清的溶液；

(5)将步骤(4)制得的一抗样品浸入含有质量百分比浓度为0.1％的山羊抗兔IgG的溶液中，摇床孵育1.5～2.5h，分别用PBST溶液和PBS溶液冲洗，经DAB溶液避光显色8～12min，PBS冲洗，然后经脱水、封片，即得。