[发明专利]一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法

权利要求书

1.一种制备家鸽肠壁肌间神经丛内NOS神经元样品的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）按0.04～0.06mg/kg向家鸽注射肌松药，5～30 min后处死家鸽，取家鸽肠道，清理肠道内容物，制得待观察肠道；

所述家鸽体重300～340g；

（2）取步骤（1）制得的待观察肠道，结扎小肠的一端，用含有多聚甲醛质量百分比浓度为3.6～4.4%的磷酸缓冲液灌注后，结扎小肠的另一端，在4℃条件下，置于含有多聚甲醛质量百分比浓度为3.6～4.4%的磷酸缓冲液中固定6～8 h，转至含200～350g/L蔗糖的磷酸缓冲溶液中，4℃条件下脱水过夜，制得固定后样品；

所述磷酸缓冲液为含有多聚甲醛质量百分比浓度为4%的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液为质量浓度0.75%的磷酸缓冲液；

（3）将步骤（2）制得的固定后样品截段后，剥离肌层，将肌层浆膜面向下平铺于载玻片上，然后剥离神经丛上的纵形肌，保留环形肌层，置于磷酸缓冲液中保存，制得待染样品；

所述截段为剪成1 cm长的肠段；所述剥离肌层的步骤如下：

将肠段套在玻璃棒上，用大头针沿肠管纵轴划痕，眼科镊沿划痕处轻轻剥离肌层；

所述磷酸缓冲液为质量浓度0.75%的磷酸缓冲液

（4）将步骤（3）制得的待染样品经磷酸缓冲液冲洗后，室温置于质量浓度为2.5～3.5%的H₂O₂中25～35 min，然后经磷酸缓冲液冲洗后，浸入封闭液室温封闭0.8～1.2h，然后浸入含有质量百分比浓度为0.2～0.5%的一抗溶液中，4℃过夜，然后室温孵育0.8～1.2h，PBST冲洗，制得一抗样品；

所述一抗为兔抗NOS抗体；

所述封闭液为每百毫升PBST溶液含有5毫升山羊血清的溶液；

（5）将步骤（4）制得的一抗样品浸入含有质量百分比浓度为0.1%的山羊抗兔IgG的溶液中，摇床孵育1.5～2.5h，分别用PBST溶液和PBS溶液冲洗，经DAB溶液避光显色8～12min，PBS冲洗，然后经脱水、封片，即得；

所述脱水为分别采用体积百分比浓度为75%、95%和100%的酒精逐级脱水，然后用二甲苯置换酒精。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，肌松药的注射量为0.05mg/kg。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，清理肠道内容物为用含浓度为10^-4 mol/L尼莫地平的质量浓度0.75%的磷酸缓冲液冲洗。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，小肠为按解剖位置分离的小肠。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，冲洗次数均为3次，每次冲洗时间5～15min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，PBST溶液冲洗次数为4次，每次冲洗时间5～15min；第一次PBS溶液冲洗次数为1次，冲洗时间5～15min；第二次PBS溶液冲洗次数为3次，每次冲洗时间5～15min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，封片为采用中性树胶封片。