[发明专利]一种表达重组蛋白的CHO细胞的培养方法

说明书

本发明属于蛋白质医药生物工程与技术领域，公开了一种表达重组蛋白的CHO细胞的培养方法，在细胞培养过程中添加唾液酸。实验表明，本发明在细胞培养过程中添加唾液酸可以提高表达重组蛋白的唾液酸化水平。并且唾液酸本身就是唾液酸化过程的底物，添加的唾液酸会通过酶促反应加到蛋白糖基化的最末端，不会带来风险，而且价格相对较低，可以实现大规模生产中使用。

技术领域

本发明属于蛋白质医药生物工程与技术领域，具体涉及一种表达重组蛋白的CHO细胞的培养方法，尤其是一种提高表达重组蛋白的唾液酸化水平的CHO细胞的培养方法。

背景技术

生物制品目前已经成为治疗用药市场的重要组成部分。目前治疗用生物制品主要包括抗体类、细胞因子类和多肽类(如各种胰岛素制品)，这些生物制品都是通过基因重组技术由不同宿主细胞或宿主菌表达的。其中抗体类和绝大多数细胞因子类产品是由哺乳动物细胞表达后经纯化得到的，因为这些药物都具有糖基化修饰。

糖基化修饰对抗体或细胞因子类生物制品的生物学活性和稳定性具有重要作用，比如抗体的ADCC效应主要就是由其Fc段的糖链介导的。糖基化修饰是一个非常复杂的过程，不同蛋白分子的糖基化类型都不一样，甚至同一蛋白分子上不同糖基化位点上的糖链也不一样，而且存在不均一性。由于糖链对蛋白分子药物结构和功能的重要性，以及糖链本身的高度复杂性，糖基化控制成为蛋白药物生产和质量控制中非常重要的一部分。

糖基化类型包括很多种，每种糖链类型都会对蛋白药物产生不同的影响，比如高甘露糖修饰会降低蛋白药物在人体内的半衰期，而糖链分子最末端的唾液酸化水平会延长蛋白药物的半衰期，这些都对药物的药代动力学PK产生很大的影响。绝大多数抗体药物只有一个糖基化位点，且该糖链末端的唾液酸化程度都非常低。许多细胞因子类和融合蛋白类药物都有多个糖基化位点，不同位点上的糖链都有不同程度的唾液酸化，唾液酸化水平对这些蛋白的半衰期和PK会产生很大的影响，比如EPO，FSH等。因此必须控制好这些药物的唾液酸化水平。

具有糖基化的细胞因子和融合蛋白都是通过培养哺乳动物细胞表达的，CHO细胞是其中使用最普遍的表达细胞。哺乳动物细胞在生物反应器中的培养过程中，会受到培养及组分，温度，溶氧，pH等多重因素的影响，会使其产生不同的糖基化修饰类型和比例。目前广泛使用的CHO细胞在正常培养条件下只能产生小于5％的唾液酸化修饰，造成表达蛋白的半衰期较短，无法满足临床治疗的要求。

目前，文献报道的提高CHO细胞表达蛋白唾液酸化水平的方法主要包括在培养基中添加ManNAC、Mn离子、地塞米松等。但这些添加物价格昂贵，而且不容易从最终的药品中除去，存在风险。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种表达重组蛋白的CHO细胞的培养方法，以提高表达蛋白的唾液酸化水平。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

申请人通过在表达重组人卵泡刺激素(FSH)和重组人VEGFR-Fc融合蛋的CHO细胞培养过程中添加一定浓度的唾液酸，如N-乙酰神经氨酸(NANA)，可以获得唾液酸化水平较高的表达重组蛋白，唾液酸化水平达到实际标准。其中表达重组人卵泡刺激素的CHO细胞的唾液酸含量达到8-12mol/mol蛋白，表达重组人VEGFR-Fc融合蛋白的CHO细胞的唾液酸含量达到8-12mol/mol蛋白。因此本发明提供了唾液酸在提高CHO细胞表达重组蛋白的唾液酸化水平中的应用。

其中，所述唾液酸为N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸、去氨基神经氨酸或神经氨酸中的至少一种。

进一步本发明提供了一种表达重组蛋白的CHO细胞的培养方法，在细胞培养过程中添加唾液酸。

其中，作为优选，所述唾液酸的浓度为5～10mM。更优选为5mM。