[发明专利]一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

说明书

本发明提供了一种生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。具体地，本发明提供了一种多肽在生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸或以反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸为前体的下游产物中的用途。本发明还提供了生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法，所述方法包括培养表达所述多肽的菌株，从而得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。本发明还提供了一种反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株，以及所述反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株的构建方法。利用本发明的方法可高效、低成本地产生反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种多肽在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物生产中的用途，以及一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称羟脯氨酸)，是一种具有独特生理活性的氨基酸,易溶于水，广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等领域，市场前景广阔，由于价格昂贵羟脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯类抗生素(美罗培南等)的侧链。碳青霉烯类是第三代抗生素，是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，全球总体市场已超过了30亿美元。

反式-4-羟基-L-脯氨酸可以通过脯氨酸4-羟化酶催化L-脯氨酸羟基化来生产，目前用于生产L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)等，但是这些菌都没有编码脯氨酸4-羟化酶的基因。因此，挖掘能够在L-脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的脯氨酸4-羟化酶是实现反式-4-羟基-L-脯氨酸工业生产的关键。

脯氨酸4-羟化酶的催化反应

日本协和发酵公司通过筛选得到一株脯氨酸4-羟化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名为指孢囊菌RH1，测序获得脯氨酸4-羟化酶基因序列(CN96190335)；该脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中异源表达主要形成包涵体，进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下，导入到大肠杆菌中，添加外源L-脯氨酸，在发酵罐中转化100小时后，反式-4-羟基-L-脯氨酸的积累量达到41g/L，转化效率只有87％(Shibasaki,Takeshi,Hideo Mori,and AkioOzaki.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-andstereospecific hydroxylation of L-proline.Bioscience,biotechnology,andbiochemistry 64.4(2000):746-750)。为了进一步降低反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产成本，日本协和发酵公司又将密码子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因导入到L-脯氨酸生产菌中，在以葡萄糖为底物的发酵培养基中培养99小时后反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L，发酵温度为33℃，发酵过程中L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L，初步实现了羟脯氨酸的从头合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi,et al.Construction of anovel hydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene.Journal of bioscience and bioengineering 90.5(2000):522-525.)，该文献水平为目前报道的最高水平。