[发明专利]双特异性抗体及其制备方法与用途

说明书

本发明提供一种双特异性抗体，包含完整双链抗体K1、单链抗体K2以及连接第一和第二功能域之间的连接肽L，且其组成通式为K1‑L‑K2。所述连接肽由柔性肽和刚性肽组成，其中，所述柔性单元包含Gly和Ser；和所述刚性单元包含人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽，且包含至少2个糖基化位点；本发明提供的双特异抗体使用的连接肽具有广泛适用性和可移植性，刚性单元和柔性单元的组合序列，则能赋予连接肽具有介于完全刚性和完全柔性之间的构象，且可保护双特异性抗体不易在连接区被降解。该双特异性抗体还具有起效剂量低的优势，可预期降低临床给药剂量。

技术领域

本发明涉及双特异性抗体领域，更具体地，涉及一种双特异性抗体及其制备方法与用途。

背景技术

近二十年，蛋白融合技术已广泛应用于构建双功能抗体、双功能酶和双功能蛋白等。然而，在构建融合蛋白过程中遇到了各种问题，例如在单独表达时能正确折叠的蛋白在融合蛋白中不能正确折叠；融合的两个蛋白因空间距离靠近从而导致活性位点被屏蔽；融合蛋白分子因不能正确折叠或其构象变化原因而容易被蛋白酶降解；原本具有一定柔性的蛋白催化域在融合之后失去了原有的功能等。这些问题的出现，往往导致融合蛋白活性降低甚至完全丧失。一般认为，构建融合蛋白后，原蛋白分子的活性会有一定程度的下降；一个有意义的融合蛋白是其各部分的活性保持在原蛋白分子的50％以上。为了解决以上问题，人们对融合蛋白的设计和构建进行了许多研究和探索，以期提高融合蛋白的活性。如通过改变融合蛋白的首尾顺序，变换不同的融合位点，采用不同的融合配体，或采用连接肽等方法。

相比于其它融合策略，使用连接肽(linker)具有多种优势。第一、组成连接肽的氨基酸具有多样性(20种常见氨基酸)，而且连接肽长度也是重要可调参数，由此可带来连接肽丰富的多样性(20的n次方种，n是连接肽的氨基酸残基数)，有利于对其进行工程改造；第二、连接肽能为两个待融合蛋白提供一定的空间间隔，以达到趋向于正确折叠而不相互干扰；第三、连接肽还能为两个待融合蛋白提供更多相互作用的可能性，促进相互间协同作用。

目前常用的连接肽有两种，螺旋形式的刚性连接肽(如A(EAAAK)_nA)和由低疏水性、低电荷效应氨基酸组成的柔性连接肽。螺旋形式的刚性连接肽能有效分开融合蛋白的不同功能区。柔性连接肽的例子包括Huston设计的(GGGGS)₃序列。另外，人绒毛膜促性腺激素(hCG)β链的羧基末端肽(以下称其为CTP)也有报道可以单独作为连接肽，主要用于连接同一个蛋白的不同亚基。例如，中国专利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公开的融合蛋白中，CTP作为接头，位于促卵泡激素的beta亚基和alpha亚基之间；专利WO2005058953A2公开的融合蛋白中，CTP作为接头，用于连接糖蛋白激素beta亚基和alpha亚基。但是，CTP因为具有延长某些蛋白体内半衰期的作用，因而在更多的专利文献中主要被公开作为融合蛋白中的延长半衰期部分，该部分可以选择使用免疫球蛋白Fc、CTP或其他能延长半衰期的融合配体。