[发明专利]一种马铃薯酪氨酸酶提取及最佳反应时间确立方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种马铃薯酪氨酸酶提取及最佳反应时间确立方法。

背景技术

酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，其广泛存在于植物体，微生物体和人体中，与生物体色素合成有关，是1种结构复杂的含多亚基的含铜氧化还原酶，不同来源的酪氨酸酶都含有铜离子结合位点，1个酪氨酸酶分子可以结合2个铜离子形成双核铜离子活性中心，每1个铜离子能结合3个组氨酸，在黑色素的合成过程中，有3种形式的酪氨酸酶参与催化反应，分别是氧化态(Eoxy)、还原态(Emet)和脱氧态(Edeoxy)，三者的区别在于双核铜离子活性中心的结构不同。

酪氨酸酶应用有着多种生物学功能，不仅在医疗、美容、食品等方面得到广泛的应用，特别是在皮肤美白方面有重要的功效，另外结合固定化，生物传感器等技术，在有机合成、环境保护、生物检测等领域，利用酪氨酸酶进行催化氧化、处理工业废水、检测化合物等方向已经逐渐成为目前国内外研究的热点。

黑色素，主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞(melanocyte)产生，它能减少紫外线对皮肤的伤害。黑色素的含量及分布决定了皮肤的颜色。然而，黑色素在基底层的异常蓄积会造成色素沉着过度引起黑斑病、雀斑、老年斑等，从而影响人的面部美观。

黑色素的合成必须要有三种物质，主要是原料酪氨酸，催化酪氨酸的主要限速酶酪氨酸酶，酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶，还有参与此过程的氧元素，黑色素的生物过程即为：在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化为多巴醌，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌。

多巴醌不稳定，会自动氧化生成多巴和多巴色素。多巴色素的反应产物5，6-二羟基吲哚(DHI)和5，6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)经一系列的氧化反应生成真黑素，其为皮肤的色素主要组分。在半胱氨酸或者谷胱甘肽存在的条件下，多巴醌会转变成半胱氨酰多巴，最后生成褐黑素。

酪氨酸酶制备目前实验室已采用从多种生物中分离，主要有真菌、细菌、裸子植物、被子植物、昆虫、脊索动物类等。常见原料多从植物中例如蘑菇、马铃薯等提取，制备困难而且不稳定，保存很受温度光线等的影响，现在很多酪氨酸酶多从国外公司购买，价格昂贵。

因此，本发明在结合传统的马铃薯提取酪氨酸酶基础之上，如何寻找最合适Na₂HPO₄-HCI体系，充分考虑其PH值，酶与底物反应体系的配比，反应时间等多种因素，寻找最佳条件。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种马铃薯酪氨酸酶提取及最佳反应时间确立方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括试剂与仪器：马铃薯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、硫酸铵、L-左旋多巴、高速组织匀浆机、真空抽滤机、低温冷冻离心机、真空冷冻干燥机、UV-260紫外分光光度计；

0.05mol/L磷酸缓冲液的配制：先各自配制0.2mol/L的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄250ml，按照1:1的比例配制得到0.1mol/L的PBS缓冲液，并用0.1mol/L的调节PH在6.8；

酶提取方法包括以下步骤：

(1)称取洗净的马铃薯，去皮切成小丁500g，于冰箱里预冷10小时，加入20g经过滤的交联聚乙烯吡咯烷，按照土豆比例加入0.1mol/L的缓冲液，用高速组织捣碎机匀浆，再用纱布抽滤，此过程应保证迅速，防止马铃薯酪氨酸酶氧化；

(2)将所得的粗酶液置于烧杯中，并加保鲜膜密封，整个过程均置于冰盒中，用温度计测得酶液的实际温度查寻硫酸铵的饱和度表，0℃每100ml加入16.4(NH₄)₂SO₄至30％饱和度，加入过程中不停地搅拌；

(3)依次分装到50ml离心管中，在恒温冰盒静置沉淀30min，在4℃、8000r/min离心15min；

(4)取出离心管于冰盒中，保证温度取上清溶液继续加入(NH₄)₂SO₄，100ml加入43.6g，达到70％饱和度，4℃，8000r/min离心20min，取出离心管去上清，下层沉淀用缓冲液溶解；

(5)放置于冰箱速冻，再于真空冷冻干燥机中干燥，粗酶干燥粉末；