[发明专利]一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于重组蛋白的制备方法技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法。

背景技术

EF-Tu蛋白是结核分枝杆菌反式翻译过程中重要的延伸因子，参与调控结核分枝杆菌在应激条件和正常的指数生长状态下的蛋白合成过程。EF-Tu蛋白作为分子开关调节蛋白合成的活性状态和非活性状态。在活性状态，EF-Tu与GTP结合，EF-Tu·GTP协助aa-tRNA准确结合至核糖体A位点，GTP水解为GDP，EF-Tu与GDP结合，即为非活性状态，EF-Tu·GDP从核糖体上释放，完成一轮的蛋白合成。近来研究发现，结核分枝杆菌EF-Tu（MtbEF-Tu）蛋白不仅是调控蛋白合成的关键因子，还在缺氧和高盐条件下大量产生、与结核分枝杆菌细胞壁相关（结核分枝杆菌易产生耐药性的关键因素是具有独特的细胞壁成分）、参与结合人的血纤维蛋白溶酶原，成功进入宿主。因此，MtbEF-Tu蛋白可以作为极具潜力的抗结核病药物靶标。结核分枝杆菌蛋白表达与纯化较为困难，进而阻碍了相关蛋白生化功能的研究进展。本发明涉及的MtbEF-Tu蛋白的表达与纯化方法为该蛋白结构生物学研究提供了前提条件，也为后续抗结核病新药研发奠定一定的基础。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种高表达且构象正确折叠的结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法。

为此采用如下的技术方案：

一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，所述蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

所述的蛋白质为如下1)-2)所示的蛋白质：

1) 氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示组成的蛋白质；

2) 将SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列和/或核苷酸序列进行一个和或几个

氨基酸/核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；

一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，采用如下步骤：

1) 以来源于结核分枝杆菌（菌株类型：H37Rv）的延伸因子EF-Tu的全长编码基因为模板，利用PCR技术获得结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的全长编码序列，利用Nde I与HindIII限制性内切酶同时双酶切产物与载体pET-28a，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物；

2) 制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至公司进行基因测序，测序成功，获得pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒;

3)制备B834(DE3)感受态细胞，将2)获得的pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒转化至B834(DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；

4) 挑取单菌落于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基，在37℃条件下过夜培养，按照1：100的比列接入1L含有50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基中，培养至OD_{600 nm}值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.5 mM的IPTG于25℃诱导8 h，收集菌体；

5) 将上述菌体重悬于裂解缓冲液中（pH 7.6，20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl， 10 mM MgCl₂，10 %甘油），超声破碎，离心，收集上清；

6) 将上清过滤后利用Ni-NTA柱亲和层析法纯化；

7) 将6)中获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白液置于浓缩管中浓缩，获得高浓度的MtbEF-Tu蛋白；

8) 利用圆二色谱技术（CD）测定步骤7)中获得MtbEF-Tu蛋白，实验结果表明：该重组蛋白的二级结构折叠较好，以β折叠为主。

9) 利用动态光散射技术（DLS）与核磁共振技术（NMR）测定步骤7)中获得MtbEF-Tu蛋白，实验结果表明：该重组蛋白在溶液中以单体形式存在，且折叠较好，具有很好的三级结构。

连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:4；重组质粒和B834(DE3)感受态细胞体积比为1:70。