[发明专利]一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

2.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a)通过结核分枝杆菌EF-Tu基因的获取和克隆以及重组质粒pET-28a-MtbEF-Tu的构建；

b)制备B834(DE3)感受态细胞，将a)获得的重组质粒转入该感受态细胞中，获得重组菌株；

c)在25℃、200 rpm、0.5 mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）条件下诱导b)获得的重组菌株8 h，获得MtbEF-Tu蛋白的大量上清表达；

d) 采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化c)获得MtbEF-Tu重组蛋白；最后利用浓缩管浓缩蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1) 以结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu的全长编码基因为模板，利用PCR技术获得结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的全长编码序列，利用Nde I与Hind III限制性内切酶同时双酶切产物与载体pET-28a，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物；

2) 制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，获得pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒；

3)制备B834(DE3)的感受态细胞，将2)获得的pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒转化至B834(DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；

4) 挑取单菌落于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基，在37℃条件下过夜培养，按照1：100的体积比例接入1L含有50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基中，培养至OD_{600 nm}值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.5 mM的IPTG于25℃诱导8 h，收集菌体；

5) 将上述菌体重悬于裂解缓冲液中，超声破碎，离心，收集上清；

6) 将上清过滤后利用Ni-NTA柱亲和层析法纯化；

7) 将6)中获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白液置于浓缩管中浓缩，获得高浓度的MtbEF-Tu蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:4；重组质粒和B834(DE3)感受态细胞体积比为1:70。

5.根据权利要求3所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：所述裂解缓冲液含20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，10 mM MgCl₂，10 %甘油，pH 7.6。