[发明专利]用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法

说明书

本发明涉及用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法，属于烟草品种鉴定技术领域。本发明利用烟草420K高密度SNP芯片对近年来我国烟草主栽品种进行全基因组SNP分型，根据品种间多态性SNP位点筛选获得了一套适用于鉴定烤烟中烟100的特异性SNP标记共13个，并对比栽培烟草参考基因组获得的13个SNP位点侧翼序列，其序列如SEQ ID NO:1～13所示，基于该序列设计引物；利用设计的引物，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对这些位点进行分型检测。根据检测结果获得SNP分型结果，鉴定样品是否为中烟100，本发明的检测方法检测时所需检测样品量少，检测通量高，鉴定结果准确。

技术领域

本发明涉及用于鉴定烤烟中烟100的引物组合及试剂盒、应用及检测方法，属于烟草品种鉴定技术领域。

背景技术

烟草是一种重要的经济作物，是卷烟生产的主要原料。烤烟品种中烟100是中国烟草遗传育种研究(北方)中心采用优质品种NC82为中心亲本与多抗性互补亲本9201杂交，再用NC82回交5代后，用系谱法定向选择培育而成的优质多抗烤烟新品种，2002年12月通过全国烟草品种审定委员会审定。植株筒形，着生叶数24片左右，可收叶20～22片，叶形椭圆，叶面稍皱，叶尖渐尖，叶色绿，腰叶长65.6cm，宽30.1cm。花枝较松散，花冠粉红色，蒴果卵圆形。移栽至中心花开放59～63天，大田生育期116天左右。中烟100是近年来我国烟叶生产中重要的主栽烤烟品种，也是卷烟生产中重要的工业常用品种。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。与传统的分子标记相比，SNP标记具有密度高、分布范围广、分型简单等优点。随着全基因组序列鉴定技术以及自动化的SNP芯片分型技术的发展，利用大规模、高通量SNP芯片进行遗传多样性研究已经变得越来越普遍。国家烟草基因研究中心设计研制出首张烟草高密度SNP芯片(420K Tobacco SNP array)，涵盖绝大多数标签SNP位点并均匀分布整个烟草基因组，为从全基因组水平上对烟草品种进行遗传多样性研究提供了便利。采用烟草高密度SNP芯片标记技术对烟草主栽品种的遗传多样性进行分析，可以筛选获得特定主栽品种的特异性SNP分子标记。基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的MassARRAY分子量阵列平台可以针对SNP位点设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有极高性价比。特别适合于对有限数量的SNP位点进行大规模分型检测。

品种是优质烟叶原料生产的基础，是影响烟叶品质最主要的因素之一。根据《中华人民共和国种子法》和《烟草专卖法》，为保证烟叶生产的稳定性和可持续发展，必须选用经全国烟草品种审定委员会审(认)定的品种，严禁种植劣杂品种。此外，烟草工业生产和产品开发对特定烟叶品种也提出了严格的要求。目前，我国面临着烟草主栽品种的遗传背景狭窄，形态学上相似程度高难以区分鉴别的问题。烟草品种的检测方法主要是田间种植鉴定法。但是，该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多(鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等)、周期长(跨越烟草不同生育期)、鉴别难度大(性状指标差异小)、同一性状年度间存在差异(受环境影响)等不足。烟草品种保护，种子纯度的监测，烟叶真假检测等方面，都迫切需要从分子水平上进行烟草DNA身份鉴定。

专利CN105734141A公开了一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，包括：分别提取对照与待测烟草品种的基因组总DNA，采用最新测序技术对其进行适当深度的全基因组测序，基于烟草基因组参考序列利用生物信息学手段对它们进行序列拼接、组装与全基因组序列比较，统计二者碱基差异，计算出待测烟草品种相对于对照烟草品种的纯度百分比。该方法不受环境条件和季节影响，鉴定结果准确可靠，可从最小遗传单位单碱基变异水平上准确鉴别烟草品种的纯度，用于烟草品种亲本提纯与真伪鉴定。但是该方法操作复杂，检测成本非常高。

发明内容