[发明专利]猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBRGreenI荧光定量PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，尤其是猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒。

背景技术

致病性大肠杆菌是危害养猪业的重要病原菌，容易引起人和动物不同病型疾病，广泛存在于生活环境中，不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且还严重威胁着人类健康。目前，治疗致病性大肠杆菌病菌，主要采用的是抗生素，抗生素的大量滥用，也使得大肠杆菌的耐药菌株逐渐增多。尤其是近年来氟苯尼考作为广谱抗菌药被大量滥用，大肠杆菌对氟苯尼考耐药性日益严重。

为此，也有研究者对大肠杆菌耐药性以及氟苯尼考耐药基因、机制以及同源性等进行了研究与分析，如李颖等《大肠杆菌耐药性及氟苯尼考耐药基因floR的研究》，曾芸等《大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考耐药机制的初步研究》，刘静等《保定地区不同动物源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因flor的同源性分析》等等，但是，现有技术中，并未存在对大肠杆菌氟苯尼考耐药基因提供快速准确诊断的PCR诊断试剂盒，使得对大肠杆菌氟苯尼考耐药基因的诊断和检测依然存在着操作繁杂、敏感性低，费时费力等缺陷。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，包括40μL混合引物、250μL Premix Ex Taq、20μL ROX Reference Dye、100μL DL2000、500μL RNase Free dH2O、20μL阳性对照、20μL阴性对照；其中，混合引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5`-GCTCAACGTGAGTTGGATCATA-3`，下游引物为5`- CACTGCTGCTGATGGCTCCTTTC-3`。

所述的阴性对照为超纯水。

所述的阳性对照为pMD-18T-floR阳性质粒。

所述的试剂盒，在-20℃下保存≤12个月。

所述的混合引物，浓度为10μmol/L。

具体本发明创造在研究过程中，是通过如下试验进行的：

一、材料与方法

1、材料

1.1实验菌株

大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株、大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株；

以上菌株均由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室保存。

1.2主要试剂以及仪器

2×Taq PCR Mastermix、Goldview、1XTAE、DL2000、DH5α、 pMD-18T、细菌的DNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green I荧光定量PCR 酶(ROX Reference Dye)、RNase Free dH2O等购自宝生物(大连) 工程有限公司；荧光定量PCR仪为Eppendorf Mastercycler ep realplex 4 实时荧光定量PCR仪。

2、实验方法

2.1引物设计

根据GenBank中floR基因设计1对特异性引物，用于扩增目的的基因片段，引物序列为：上游引物：

5`-GCTCAACGTGAGTTGGATCATA-3`，下游引物:5`- CACTGCTGCTGATGGCTCCTTTC-3`，该引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

2.2DNA提取

将大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株、大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株中的DNA 提取参照细菌DNA快速提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA在 -20℃保存。

2.3pMD-18T-floR阳性标准品的构建

2.3.1荧光定量PCR扩增

PCR扩增在25μL体系中进行，上下游引物各1μL(10μ mol/L)、2×Taq PCR Mastermix 12.5μL、ROX Reference Dye 0.5μL、模板1μL，加RNase Free dH2O至25μL，反应条件为：94℃5min； 94℃1min，55℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min；取5μL PCR扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。