[发明专利]一种微囊藻藻株纯培养的预处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及微囊藻藻种分离纯化的预处理的方法，具体涉及一种基于有效降低微囊藻附生菌的微囊藻藻株纯培养的预处理方法。

背景技术

目前，国际上有四种去除微囊藻附生菌的方法：抗生素法、化学试剂法、紫外照射法和平板涂布法。(1)利用抗生素对蓝藻进行除菌的优点是周期短、见效快，近年来越来越多的研究者选择用此法进行蓝藻的纯化。(2)某些化学试剂具备较强的杀菌或者抑菌效果，但蓝藻对其却表现出一定的耐受性，根据这种差异性可选择合适的化学药品对蓝藻进行纯化。(3)紫外照射方法是基于蓝藻和细菌在抵抗紫外照射方面的差异性上建立起来的，由于蓝藻在紫外照射下会启动自身的保护机制，因此相对细菌而言具有较高的抗UV能力。(4)平板涂布与划线是得到纯培养物最传统经典的方法，将藻液涡旋震荡后加入固体培养基倒平板后进行分离。此方法优点在于成本低、操作方便并且对藻细胞本身伤害小。前三种方法均可能对微囊藻的生长速率、藻细胞密度、和叶绿素含量产生影响，使微囊藻的受到不可逆的伤害。从而分离出的微囊藻藻株常与野外藻株存在较大差异。此外，经典的平板涂布法往往缺乏有效的、必要的预处理措施，因此去除附生菌不彻底，无菌化周期较长，有时需反复多次涂布才能得到无菌株，且对于含胶被的微囊藻来说成功率更低。为了进一步研究微囊藻水华形成的机理，应当选择更加温和有效的方法将野外微囊藻群体分离纯化为微囊藻藻株。然而，野外微囊藻群体产生大量胞外多糖(EPS)，包括包裹在细胞外的胶鞘多糖(bEPS)和释放到周围环境中的水溶性多糖(sEPS)，胶鞘多糖中常伴生着许多附生菌。如果在分离纯化的过程中，为去除附生菌而采取抗生素抑制或紫外照射杀菌等，则很可能使得微囊藻本身生理结构发生改变，从而失去原有的某些能力(如：聚集形成群体的能力)。因此发明一种温和有效的去除微囊藻附生菌的方法有助于微囊藻的“无伤”纯化，并为进一步明确藻菌关系、获得纯培养的微囊藻藻株奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效简便地减少微囊藻群体胞外多糖(EPS)中附生菌，获得无菌微囊藻藻株的方法，为一种微囊藻藻株纯培养的预处理方法。

为实现上述发明目的，本发明的微囊藻藻株纯培养的预处理方法为在实施平板划线法前，在弱碱性条件下对藻悬液进行恒温水浴加热，以去除微囊藻胞外多糖中的附生菌从而高效获得无菌微囊藻藻株。

优选地，所述澡悬液通过对野外微囊藻群体进行水洗、振荡得到。

优选地，恒温水浴加热的温度为28～30℃。

进一步优选地，恒温水浴加热的温度为30℃。

优选地，所述弱碱性条件为：调节体系pH为7～9。

进一步优选地，调节体系pH为8。

本发明的分离纯化方法相比于经典平板涂布法，加入了在弱碱性条件下温水浴加热这一步骤，更有利于微囊藻群体胶鞘多糖溶解，实现附生菌的有效去除，具有快速、应用范围广、高效等优势。

在一种优选的实施方式中，本发明通过如下方法高效控制微囊藻附生菌从而高效获得无菌微囊藻藻株：

(1)先将采集的野外微囊藻群体的水样先过200μm筛网，再用5μm滤膜过滤后收集滤膜；

(2)用无菌去离子水预先清洗滤膜一次，即随后将滤膜放入无菌试管中，并向无菌试管加入适量无菌去离子水，用旋涡混合仪震荡2～3分钟至滤膜上的藻类群体基本打散后，用无菌镊子取出滤膜，得到微囊藻悬液；

(3)将盛有微囊藻悬液的试管内pH调节为7～9，优选地，用NaOH溶液调节，随后将振荡后的试管放入恒温水浴锅中，并在28～30℃下水浴加热3～5h小时；

(4)将水浴加热后的微囊藻悬液过滤到5μm滤膜上，用无菌去离子水清洗数次次；

(5)将水浴加热后的滤膜取出，放入无菌试管中，加入无菌BG-11培养液，振荡1分钟，制成纯净的藻悬液。；

(6)：平板划线法分离纯化微囊藻