[发明专利]微滴式数字PCR探针法反应体系、检测方法和应用

权利要求书

1.一种微滴式数字PCR探针法反应体系，其特征在于，包括连续相试剂和分散相试剂；所述连续相试剂包括氟油与氟表面活性剂，所述表面活性剂为全氟聚醚和/或含全氟聚醚的嵌段氟化合物；所述分散相试剂为微滴式数字PCR反应试剂。

2.如权利要求1所述的微滴式数字PCR探针法反应体系，其特征在于，所述氟油选自C₉H₅F₁₅O、C₁₂F₂₇N及C₉F₂₁N中的至少一种。

3.如权利要求1所述的微滴式数字PCR探针法反应体系，其特征在于，所述氟表面活性剂选自如下结构式表示的二嵌段共聚物化合物中的至少一种：

且所述氟表面活性剂的平均分子量为4000-9000，其中n选自20-60的整数，m选自9-40的整数。

4.如权利要求1所述的微滴式数字PCR探针法反应体系，其特征在于，所述氟表面活性剂选自三嵌段共聚物PFPE-PEG-PFPE及PFPE-LPG-PFPE中的至少一种。

5.如权利要求1～4中任一项所述的微滴式数字PCR探针法反应体系，其特征在于，所述连续相试剂为包含氟油与氟表面活性剂的混合液，其中，所述氟油与所述氟表面活性剂的质量比为98:2至90:10。

6.如权利要求1～4中任一项所述的微滴式数字PCR探针法反应体系，其特征在于，所述分散相试剂中dNTP的浓度为0.2-0.4mM，Tris-HCl的浓度为10-100mM，(NH₄)₂SO₄的浓度为10-30mM，MgCl₂的浓度为1.5-5mM，热启动Taq酶的浓度为0.5-1U/μl，BSA的浓度为0.05-0.5wt％。

7.一种检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1～6中任一项所述的微滴式数字PCR探针法反应体系。

8.一种微滴式数字PCR探针法检测方法，其特征在于，使用如权利要求1-6中任一项所述的微滴式数字PCR探针法反应体系，所述微滴式数字PCR探针法检测方法包括如下步骤：

向所述分散相试剂中加入引物对、探针和模板，所述引物对的两条引物的浓度分别为200-800nM，所述探针的浓度为200-800nM；

将所述连续相试剂及添加有引物对、探针和模板的分散相试剂分别通入微滴生成芯片的油相通道和水相通道中；

将所述微滴生成芯片中的分散相和连续相连续通过相应的通道，生成直径为20～40μm的微滴；

将生成的微滴接入低吸附PCR管中，并在PCR仪上进行PCR反应；

PCR反应完成后进行荧光强度检测分析。

9.如权利要求8所述的微滴式数字PCR探针法检测方法，其特征在于，还包括在通入分散相试剂和连续相试剂之前，对所述微滴生成芯片进行亲氟化处理的步骤。

10.如权利要求8所述的微滴数字PCR探针法检测方法，其特征在于，在PCR反应时，PCR程序要求全程升降温速率控制在2-4℃/s，具体的程序是：94℃预处理5-10分钟；94℃、10-20秒，60-65℃、60-90秒，共25-50个循环；4℃冷却1-5分钟。