[发明专利]一种基于石墨烯量子点/铒离子荧光纳米探针的凝血酶检测方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种基于石墨烯量子点/铒离子（GQDs/Er³⁺）荧光纳米探针的凝血酶检测方法，属于光学传感技术领域。

背景技术

石墨烯量子点（GQDs）是指粒径小于100 nm的石墨烯纳米片，具有低毒性、良好的生物相容性和光稳定性等性能，被广泛用于物质检测、生物成像和荧光传感。Shi等利用GQDs-PEG-aptamer为供体，二硫化钼纳米片为猝灭剂，建立了基于GQDs荧光开关检测上皮细胞粘附分子蛋白的方法。Qiu等建立了基于Zr⁴⁺与磷酸化多肽-GQDs复合物之间多重螯合作用的蛋白质激酶活性分析方法。Qian等以功能化GQDs表面偶联适配子为探针检测凝血酶。然而，以上基于GQDs的传感器往往需要对GQDs表面进行修饰，成本高且耗时长。

凝血酶（简写为TB）是一种多功能丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，具有促凝和抗凝双重特性。当血管组织损伤时，它可以促进凝血酶原转变成凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白，在血液凝固和心血管治疗中发挥着重要作用。但是，凝血过度也会导致体内血栓栓塞等疾病发生，甚至造成机体死亡。因此，对凝血酶含量进行测定对生理健康具有重要意义。目前已有的凝血酶检测方法有比色法、荧光法、电化学法和磁共振成像法等，其中，比色和荧光方法的成本低、灵敏度高、操作简单，大多数比色和荧光方法是基于凝血酶适配体与凝血酶反应前后构象变化导致的荧光变化实现凝血酶检测。Zheng等以DNA为模板合成Ag/Pt双金属纳米簇，用于比色法检测凝血酶。Li等设计了一种发夹结构的DNA，当加入凝血酶后，此发夹结构的环序列与凝血酶特异性结合，环状DNA开环使得标记于DNA两端的荧光供体和猝灭剂距离变远，荧光供体的荧光恢复，实现了凝血酶检测。然而，以上基于适配体的凝血酶检测方法大多需要对适配体进行化学修饰或标记荧光基团，不仅耗时、复杂而且价格昂贵。因此，发展免标记型荧光传感法用于检测凝血酶尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于石墨烯量子点/铒离子荧光纳米探针的凝血酶检测方法，该方法利用凝血酶存在与否时GQDs/Er³⁺荧光纳米探针的荧光开关变化实现对凝血酶的检测，具有简单、免标记、灵敏和选择性好等特点。

本发明是这样实现的，一种基于石墨烯量子点/铒离子荧光纳米探针的凝血酶检测方法，其特征在于，GQDs溶液有良好的荧光发射性质，当将Er³⁺加入到GQDs溶液中时，GQDs表面存在的羰基、羧基、羟基以及环氧基等含氧基团可与Er³⁺发生配位作用形成GQDs/Er³⁺复合物，从而拉近了GQDs之间的距离，使得GQDs发生聚集而荧光猝灭，当向GQDs/Er³⁺中加入凝血酶后，凝血酶与GQDs竞争Er³⁺的结合位点，使得GQDs从GQDs/Er³⁺复合物中脱离而分散到溶液中，导致GQDs的荧光恢复，随着凝血酶浓度的增加，GQDs的荧光恢复的程度逐渐增强，GQDs的荧光强度与凝血酶浓度呈线性关系，可用于对凝血酶的灵敏和选择性检测；

所述的GQDs制备步骤如下：

（1）将1.0 g碳粉、60 mL浓硝酸和180 mL浓硫酸依次加入到250 mL反应瓶中，在100%功率下超声2 h；

（2）将上述溶液在120 °C条件下回流24 h，将混合物用超纯水稀释到800 mL，得到深棕色溶液，用Na₂CO₃中和溶液pH为7左右，经浓缩过滤除去大部分钠盐，将滤液分批次在1000 Da透析袋中透析3天，透析袋中的产物即为GQDs，将GQDs分散到超纯水中备用。

作为优选，步骤（1）中，所述的浓硝酸的质量百分浓度为68%，所述的浓硫酸的质量百分浓度为98%。