[发明专利]食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用

说明书

本发明的目的是从食用真菌双孢蘑菇2796中分离纯化食用菌凝集素，并将其应用于棕囊藻的生长抑制中。本发明所请求保护的双孢蘑菇凝集素能够显著地抑制赤潮微藻——棕囊藻的生长，为开发环保的选择性抑制藻技术提供新思路和新方法。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用。

背景技术

凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。它具有能与糖专一性、非共价可逆结合的特点，部分凝集素还具有免疫调节和抑制肿瘤生长的作用，同时还参与生物体内的一些重要生理过程；在研究生物体内细胞癌变、受精、分化和分子识别等重要生命过程中起着重要作用，所以日益成为国内外生物研究的热点之一。凝集素按不同的分类方法可以分很多类型，主要依据其结合的糖的类型或其来源的物种进行区分。按照凝集素结合糖的类型，把自然界中的凝集素分成若干类型，就叫该糖凝集素，如：D一甘露糖凝集素、L一岩藻糖凝集素(荆豆凝集素)。按照物种的来源分类，凝集素可以分为动物凝集素(哺乳动物凝集素、无脊椎动物凝集素、昆虫凝集素等)、植物凝集素、微生物凝集素。而本发明所涉及的凝集素为食用菌凝集素，也就是植物凝集素。

食用菌又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界上最普遍研究最广的一种菇类，喜生长在粪草酵料上的一种伞菌，食用菌所含的酪氨酶有明显降低血压作用；多糖的醌类化合物与巯基结合，可抑制脱氧核糖核酸合成，在医学上，有抑制肿瘤细胞活性的作用。而双孢蘑菇2796、真姬菇以及长裙竹荪是我国20世纪90年代初选育出的一种质量好高产量的食用菌种类，得到了较大的推广与研究。

Hori等(1996)首次报道了几种陆生植物和海藻凝集素对某些海洋微藻的凝集作用；郑怡等(2002)发现坛紫菜凝集素(PHL)能够凝集一定浓度范围内的单细胞藻类；陈国强(2008)以褐藻门的铁钉菜(Ishige okamurae)的凝集素为试验材料，研究发现铁钉菜凝集素能抑制多纹膝沟藻和棕囊藻的生长。然而目前有关凝集素对海洋微藻影响的研究，主要集中在海洋大型藻类的凝集素提取、微观层面的细胞凝集反应等方面的研究，未见凝集素对微藻选择性抑制作用的研究。

发明内容

本发明提供一种食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用，明确了双孢蘑菇部分重要生化特性的影响，为开发环保的选择性抑藻剂技术提供新思路和新方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种食用菌凝集素及其在抑制棕囊藻生长中的应用，所述食用菌凝集素为双孢蘑菇2796凝集素，其提取步骤为：

取食用菌子实体，按质量体积比为1:5加入0.9%w/v生理盐水，在4℃下浸泡18h；然后用高速组织捣碎机将其均浆后再次放在4℃下浸泡4h，4层纱布过滤，弃滤渣，取滤液；在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出上清液；加入22.6%w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为40%的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，取上清；再次在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出上清液，加入12%w/v硫酸铵盐析，并用79-1磁力加热搅拌器使其混匀，以此得到沉淀为60%的饱和溶液部分，放入到4℃下18h使其充分沉淀，在4℃，9000r/min下冷冻离心,20min，取出沉淀；将沉淀溶于1mol/l的NaCl中，装入透析袋中除盐，用相同的盐浓度透析至外透析液无SO₄^2-检出为止；所得透析液聚乙二醇浓缩后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以0.05mol/l，pH7.8的磷酸缓冲液PBS对含1molNaCl的同一缓冲液梯度洗脱，检测波长280nm，分管收集，以鸽子血检测各峰的凝血活性，收集活性峰；然后活性峰上Sephadex G-100柱层析纯化，流速4ml/管，10min/管，洗脱液为0.05mol/l、pH8.0的PBS缓冲液，检测波长280nm，分管收集后检测各峰的凝血活性，收集活性峰，冷冻干燥即得所述食用菌凝集素纯品。