[发明专利]一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法

权利要求书

1.一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法，其特征在于：所述检测方法中用到试剂的Acm蛋白序列为：

DAGRDISSNVTSLTVDPTNITDGGNIKVKFSFDEKKQNIQPGDYLWINWPSEGNIRGEGFQKEIPLMIENKNVGTLTVRKDSAQVVFNENIKNLDSVEGWGQFEIQARNVTDTGEENTGPFTVTSGDKTATVNVTKPASGSSSSVFYYKTGDMLPEDTKHIRWFLNINNNGTYVEQPVKISDEIQSGQRLDPSTFEINQIHLGEQKVYRGEEGIQQFLQDFPGATFNFSVTDNYIEITIPKNFVNLRKIMVSYKTIIENPEQINFENHSEAWFKEFNKPAVDGESFNHTVKNISASGGVNGTVRGELKIFKYINDTEIGIPNVTFELRRADEQPIQGQSSILLTSNEQGEASIKGLQVGDYVVKEKEAPNWIDFDPLSSNELKFSINENDTEGVSLPIYNKKKVTNITATKIWNGGTTPRPSIYFKLFRASTNNWEPVPDAETKRLDNGITSVTWEDIQQYDDSGNEYTFKVQEVDQNGNDYVPSGYQKIENGLVVTNENK。

2.根据权利要求1所述的一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法，具体操作包括如下步骤：

血清制备：

第一步，病原菌的扩大培养：将配制的THB液体培养基121摄氏度高压灭菌15分钟，冷却后于超净工作台内分装至200毫升的培养瓶中，每瓶中装入180ml THB培养液；然后向200毫升培养瓶中接入1毫升预先制备的病原菌菌液，将接入菌液的培养瓶放入摇床，37摄氏度、180转/分钟震荡培养12～24小时后收集菌体；

第二步，灭活：以福尔马林作为化学灭活剂，灭活前先确定福尔马林对病原菌的安全灭活浓度，具体操作时先取多支试管，分别向所有支试管内加入5毫升预先制备的病原菌菌液，取用部分试管作为对照组，其余为实验组，向实验组试管内加入一定量的福尔马林，福尔马林加入终浓度从0.1％至1.0％；将所有试管置于4摄氏度环境中放置24小时，放置结束后分别从每支试管中取出0.2毫升菌液，涂抹于THB琼脂平板上，在37摄氏度环境中培养48小时，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度；检测结果显示，各菌的福尔马林安全灭活终浓度均为0.6％；依照以上安全浓度，对稀释的菌液进行灭活处理；

第三步，安全性检测：取0.2毫升灭活菌液涂抹于THB琼脂平板上，在37摄氏度环境中培养48小时，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在；将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度(107-108菌落形成单位)，用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物体内，经20d观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的；

第四步，乳化：将灭活菌液、佐剂加入烧杯，灭活菌液与佐剂重量比为1:1，用水浴锅将装有灭活菌液、佐剂的烧杯加热至30～31摄氏度，期间伴随搅拌，搅拌器距烧杯底部10毫米；乳化器转速5000转/分，进行4分钟；停止搅拌后，将烧杯内的液体置于20摄氏度环境中1小时；最后将制备的乳液分装，并余留一部分，将余留乳液置于20摄氏度环境中24小时后质检；

第五步，质量检验：剂型检验，用吸管吸取疫苗，滴几滴于水中，观察是否分散；粒度检验，用显微镜直接观察颗粒是否均匀；稳定性检验，在一个半径为10厘米的离心器中装入乳液，用离心机3000转/分钟，离心15分钟不分层，相当于保存1年以上不破乳；粘度检验，取内口直径为1.2毫米的吸管，在室温下吸满1毫升乳液，垂直放出0.4毫升所需时间作为粘度单位，以2～6秒为合格，不得多余10～15秒；无菌检验，取灭活苗1毫升，接种于T.G培养基上，于37摄氏度环境中培养72小时，之后吸取培养物，分别接种于T.G和G.A斜面，每支0.2毫升，一支置于37摄氏度环境中，一支置于25摄氏度环境中，另取0.2毫升接种于G.P培养基，于2525摄氏度环境中120小时，观察是否有细菌生长；安全性检验，取10只18～20克的小白鼠，每只腹腔注射疫苗1毫升，观察21日，小白鼠未死亡算合格；

免疫激活：

在采集受测健康绵羊的血样，即对照阴性血样，之后对受测绵羊进行两次颈部皮下血清注射，两次注射间隔3周，第二次注射后15天进行静脉攻毒，每只羊攻毒剂量为3×10⁹菌落形成单位，然后每隔1周采集一次受测绵羊的阳性血清；

Acm抗原制备：

所用材料试剂来源：AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；磁珠法基因DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pUC57-Kan载体、Pfu聚合酶、Premix Taq酶(Ex Taq 2.0plus)、DL2000DNA Marker、质粒抽提试剂盒、BamH I、Xho I限制性内切酶均购自TaKaRa公司；氨苄青霉素、卡那青霉素均购自美国Sigma公司；Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；其他基因扩增相关试剂均由苏州金唯智生物科技有限公司提供；

第一步，取上述过夜培养的菌株2毫升，放入离心管离心，按照磁珠法基因DNA抽提试剂盒说明书提取细菌DNA，负20摄氏度保存备用；

第二步，PCR扩增Acm基因：其中PCR反应体系(100微升)为：Pfu聚合酶1微升，Pfu buffer 93微升，首尾引物(10μmol/L)各1微升，基因组模板4微升；

PCR反应程序为：98摄氏度预变性5分钟；98摄氏度变性20秒，55摄氏度退火20秒，72摄氏度延伸1分钟，30个循环；72摄氏度再延伸3分钟；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测；

第三步，重组质粒pUC57-Kan-Acm的构建与鉴定：

(1)按照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书回收Acm目的基因片段；将目的基因片段与pUC57-Kan载体连接，得到重组质粒pUC57-Kan-Acm，连接体系如下：pUC57-Kan：2.0微升；纯化PCR产物：4.0微升；T4buffer：5.0微升；T4连接酶：1.0微升；去离子H2O：2.0微升；对加入的样品轻轻震荡混匀；4摄氏度放置12小时；

(2)将重组质粒pUC57-Kan-Acm转化到Trans5α感受态细胞，均匀涂于卡那抗生素抗性的LB固体培养皿，37摄氏度培养15小时左右；然后挑取10小时以上时间长出的单克隆接种至8毫升含卡那抗生素的LB液体培养基中，37摄氏度，220转/分钟摇菌过夜(12小时左右)培养；按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒；

(3)Acm基因PCR扩增检测及序列分析：用上述引物和反应条件进行PCR扩增；PCR反应体系(50微升)如下：Pfu聚合酶0.5微升，Pfu buffer 47.5微升，首尾引物(10微摩每毫升)各0.5微升，质粒模板1微升；然后将提取的质粒送苏州金唯智生物科技有限公司测序；将测序结果与GenBank中已发布的序列进行BLAST在线(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对和同源性分析，证明为屎肠球菌Acm基因；

第四步，pET32a-Acm表达载体的构建：用BamH I和Xho I酶切重组质粒pUC57-Kan-Acm，获得Acm目的基因，克隆至同样用BamH I和Xho I酶切的pET-32a(+)质粒中；

第五步，pET32a-Acm表达载体体外表达与鉴定：重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含氨苄青霉素的LB培养基中37摄氏度200转每分钟孵育，当OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG诱导表达；收集菌体，超声破碎后进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，表明Acm蛋白为大小约74ku的可溶性蛋白，最佳表达浓度为40毫克每毫升，且具有免疫原性；

第六步，重组蛋白的纯化及分析：将细胞裂解液上清按说明书经过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱(Superdex 200)进行两步法纯化，然后经过SDS-PAGE电泳和Western blot分析，纯度为85％，纯化蛋白浓度为1.20毫克每毫升；

ELISA方法的最优工作条件(步骤)：

Acm蛋白抗原的包被浓度为12微克每毫升，放置37摄氏度作用2小时后4摄氏度包被过夜，用10％马血清37摄氏度封闭1.5小时，待检血清稀释倍数为1：100，37摄氏度孵育1小时，酶标二抗最佳稀释比为1：500，37摄氏度作用15分钟，底物37摄氏度显色5分钟，临界值为0.427。

3.根据权利要求2所述的一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法，其特征在于：所述

ELISA方法的最优工作条件(步骤)：

①包被抗原：用包被缓冲液将Acm蛋白抗原稀释至12微克每毫升，包被酶标板，每孔加入100μL，37℃2h后4℃过夜；

②封闭酶标板：取出酶标板，弃液，拍干，然后向每孔加入洗涤液PBST 300μL，放置4min，弃液，拍干，重复洗涤3次。拍干后加入10％马血清封闭液，每孔200μL，37℃封闭1.5小时；

③加入阴阳性血清：PBST洗涤3次后加入1：100稀释的待检血清及阴、阳性对照血清，100μL/孔，37℃孵育1h；

④加入酶标二抗：如上PBST洗涤3次后，加入1:500稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG，100μL/孔，37℃孵育15分钟；

⑤显色：洗涤拍干后加入底物显色液TMB，每孔100μL，37℃显色5分钟；

⑥终止：加入2mol/L的H2SO4终止液，50μL/孔，终止反应；

⑦结果判定：在酶标仪上测定OD450值。当OD450值≥0.427时，可判定为阳性，OD450值＜0.427时判定为阴性。