[发明专利]检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩增引物组、检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测人 EGFR基因T790M点突变的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，位居我国城市人 口恶性肿瘤死亡原因之首。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 占所有肺癌类型的85％，逾70％患者在确诊时已处于中晚期。临床对晚期NSCLC 患者的治疗已由广谱化疗转向分子靶向治疗，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因是东亚裔肺腺癌的主要驱动基因，针对该分 子靶点进行表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)靶向治疗，可有效改善EGFR基 因敏感突变携带者的预后。然而，几乎所有靶向治疗的患者终将发生耐药，其 中50％-60％耐药机制为EGFR基因T790M突变，而三代EGFR-TKI已证实能 有效地抑制该突变。因此EGFR基因T790M突变检测已成为NSCLC患者明确 耐药机制和调整治疗方案必须参考的重要指标。随着分子生物学的发展，出现 了众多以分子生物学技术为基础的EGFR突变检测方法，如荧光定量PCR、DNA 探针、DNA芯片、DNA直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐；但这 些检测技术对检测人员技术水平要求高，并且这些技术需要的检测仪器昂贵、 检测周期长，难以实现快速检测和临床推广的目的。所以，在临床检测和科学 研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠 的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种检测人EGFR基因T790M 点突变的智能恒温扩增引物组。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种检测人EGFR基因T790M点突变 智能恒温扩增检测试剂盒。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种检测人EGFR基因T790M点突变 的智能恒温扩增检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明公开了一种检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩 增检测引物组，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核 苷酸序列分别如下所示：

FP引物：CCTATCGGCATAGGGGTCCTCCAAGTAGTTTG

TP引物：GTTCCCGGACTCCACCGTGCAGCTCATCAT

BP引物：GCAGCCGAAGGGCATGAGC

OP1引物：GCTGGGCATCTGCCTCAC

OP2引物：CCAGGTCGCGGTGCACC。

优选地，扩增反应时，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物 的摩尔比为：8：8：4：1：1。

另一方面，本发明还公开了一种检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒 温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物 组。

优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1) DNA聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂； (5)阳性对照和阴性对照。

优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中TP引物、FP引物、BP 引物、OP1引物和OP2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。

优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述错配结合蛋白为Tap Muts 错配结合蛋白。

优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、16mM MgSO₄，0.2％

优选地，阳性对照为含有检测人EGFR基因T790M突变点基因片段的T载 体克隆，阴性对照为不含人EGFR基因T790M突变点基因片段的水或其他溶剂。 更优地，阴性对照为去离子水。

优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的Green I。

再有，本发明还公开了一种检测人EGFR基因T790M点突变的智能恒温扩 增检测方法，包括如下步骤：

(1)待检样品DNA的提取；