[发明专利]检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

肽酰基精氨酸脱亚氨酶是钙离子依赖的翻译后的一种家族酶，可以催化肽酰基精氨酸残基转变为肽酰基瓜氨酸残基。PAD异构体分别为PAD1，PAD2，PAD3，PAD4，和PAD6，其中PAD4是这些同工体中唯一一个位于细胞核中的酶。PAD4可以催化组蛋白H2A，H3和H4中的精氨酸残基发生瓜氨酸化，因此可以调节下游基因的转录，分化和全能性。最近研究发现PAD4的异常表达会导致类风湿关节炎的发生，通过蛋白瓜氨酸化的过程，细胞内高水平的PAD4活性与疾病恶化自身抗体的产生有关。除此之外，在人类癌症中如肺癌，乳腺癌和骨癌中也发现大量过量表达的PAD4。所以对PAD4的检测引起了研究者对其的关注。

超分子化学是根据分子互补的原则来研究两个或更多分子的特定关联。主-客体相互作用是超分子化学的典型例子。该文章是采用具有刚性大环结构的葫芦脲作为主体分子，多肽链作为客体分子，通过主-客体相互作用自组装分子，使信号放大进而实现对靶标蛋白的检测。

虽然研究表明PAD4的异常表达与相关疾病的诊断和治疗相关，但是对PAD4催化蛋白瓜氨酸化的生理机能迄今为止知之甚少。目前为止只有一些分析方法来检测PAD酶，如比色法，SDS-PAEG，和荧光，大部分还是依赖于荧光技术。但是荧光标记过程很复杂和很容易受到外界环境的干扰，这些方法也难操作复杂，检测灵敏度也不高，很难用于实时检测与分析。因此电化学分析方法由于高灵敏性，操作简单和响应快，已经成为一门流行的检测技术。多肽可以作为原件来构建有效的生物传感器，超分子化学辅助的主-客体相互作用可以实现多肽分子自组装，从而实现信号识别与放大。银纳米颗粒通过与多肽链相互作用，在葫芦脲大分子的辅助下把信号连接在体系中。PAD4可以催化多肽链中精氨酸残基瓜氨酸化作用生成瓜氨酸残基，此时也借助胰蛋白酶的引入，该酶可以水解赖氨酸或精氨酸C端的羧基，因此可用于辅助验证精氨酸瓜基化修饰过程。所以，通过该方法技术手段检测PAD4的活性以及抑制剂的作用效果，为检测PAD4提供了一个新颖的电化学方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器。

本发明的目的之二提供该传感器的制备方法。

本发明的目的之三在于提供采用该传感器检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶的方法。

本发明是采用电化学技术对肽酰基精氨酸脱亚氨酶特异性和灵敏性的检测。为实现以上目的，本发明所采用的机理如下：

多肽链1序列为FGGGRGAC通过C端半胱氨酸的巯基以金-硫键的方式结合在金电极的表面上，多肽链2序列为FGGGGC也通过半胱氨酸的巯基与银纳米颗粒结合，在超分子葫芦脲8的辅助下，其可以结合两条多肽链FGG端，进而把多肽链2功能化的银纳米颗粒连接在电极表面上，这样才可以表征电化学信号。胰蛋白酶可以催化赖氨酸或精氨酸C端的羧基，故其可以催化裂解多肽链1中的精氨酸残基中的羧基，此时多肽链FGG片段脱离电极表面，这样葫芦脲8就不能捕捉到FGG序列，修饰多肽链2的银纳米颗粒就不能连接在电极上，得到的电化学响应也很低。精氨酸脱亚氨酶可以催化肽酰精氨酸残基转变为肽酰瓜氨酸残基，故在PAD4存在的条件下可以催化多肽链1中精氨酸发生瓜氨酸化作用。保护了多肽链1中的精氨酸免于胰蛋白酶的催化裂解，进而功能化的银纳米颗粒可以通过葫芦脲8结合两段多肽链上的FGG序列结合在电极上，得到很强的电化学信号。PAD4是一种钙离子依赖的酶，钙离子的结合可以是PAD4的构象发生改变，进而表现出催化活性。酶都有一定的活性，氯脒是一种不可逆的PAD4失活剂。在抑制剂存在的条件下，PAD4失去活性则胰蛋白酶就可以催化裂解精氨酸。不同浓度的PAD4可以根据固定在电极上的银纳米颗粒的多少，采用线性扫描伏安法的方法测定峰电流值的大小，从而实现定量检测PAD4的目的。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器，其特征在于该传感器是在金电极表面上修饰一条多肽链1，在银纳米颗粒表面修饰多肽链2，通过葫芦脲[8]介导的超分子作用可以结合芳香族氨基酸，即葫芦脲[8]结合多肽链1和多肽链2 N末端的FGG，进而把两条多肽链连接在电极上。所述的多肽链1序列为FGGGRGAC；多肽链2序列为FGGGGC。