[发明专利]一种大豆蛋白的应用及其制备方法和表达载体、引物

说明书

本发明公开一种大豆蛋白的应用及其制备方法和表达载体、引物，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma11g07260.1，将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。该大豆蛋白为植物性蛋白，对蛋白类生物制品，尤其是酶类制品，起到很好的保护作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及一种大豆蛋白的应用及其表达载体和制备方法。

背景技术

牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，现有技术多使用添加BSA(牛血清白蛋白)来保护蛋白类生物制品。例如在western blot中作为Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。但是BSA来源于动物，存在一定的使用风险，在碱性环境下很容易被被蛋白酶水解，同时因为具有多个酶切位点，所以很容易形成多种不同大小的多肽片段，可能导致目的蛋白纯度下降，并且具有潜在的血源性病原体污染，应用中并不安全。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大豆蛋白的应用及其表达载体和制备方法，旨在解决现有BSA用于保护蛋白类生物制品存在风险的问题。

本发明的技术方案如下：

一种大豆蛋白的应用，其中，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma11g07260.1，将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。

所述的大豆蛋白的应用，其中，所述冻存蛋白类生物制品为酶制剂。

一种大豆蛋白的制备方法，其中，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma11g07260.1，其制备方法包括以下步骤：

扩增目的基因：以F：3’-ATGTTTCACTCAATCAAAAC GG-5’；R：3’-TTAATTGGCGCTGGTCTGGTG-5’作为引物，以大豆R0期胚根cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

构建重组质粒：将目的基因片段与经Nde I和Xho I双酶切的蛋白表达载体PET-28a，通过T4连接酶连接酶切产物，构建pET-28a重组质粒；

转化感受态细胞：将pET-28a重组质粒转化大肠杆菌BL21Star感受态细胞；

诱导表达：将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG贮存液过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，重悬，破碎菌体，离心，取上清液，得总可溶性蛋白；

蛋白分离纯化：对所得的总可溶性蛋白进行亲和层析，分离纯化目的蛋白。

所述的大豆蛋白的制备方法，其中，构建重组质粒过程中，包括以下步骤：

将目的基因片段和经过双酶切的PET-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5μL T4连接酶，1μL 10×Buffer，用水补齐至10μL，16℃连接过夜。

所述的大豆蛋白的制备方法，其中，诱导表达过程中，包括以下步骤：

将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG贮存液，在16℃下150rmp过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，用Balance Buffer重悬，破碎菌体，在4℃，10000rmp下离心30min，取上清液。

所述的大豆蛋白的制备方法，其中，蛋白分离纯化过程中，包括以下步骤：

将总可溶性蛋白经镍离子亲和层析，利用蛋白脱盐柱去除蛋白溶液中的咪唑，将脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥，用PBS缓冲液复溶，用分子筛分离纯化凝血酶酶切产物。